EGCG抑制鼻咽癌血管生成的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分鼻咽癌血管生成的分子機(jī)制：信號(hào)傳導(dǎo)通路的不協(xié)調(diào)活化 目的： 在腫瘤的生長過程中，血管生成起著關(guān)鍵的作用，它提供豐富的養(yǎng)分和營養(yǎng)物質(zhì)；并且為腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。腫瘤細(xì)胞釋放的促血管生成因子作用于宿主內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新血管的生成。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和酪氨酸激酶受體(KDR)在血管生成中起著重要作用。而血管的成熟和穩(wěn)定又主要靠酪氨酸受體另一種亞家族Tie2和其配體血管生成素(Aaagiopioetins)

2、維持。這兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑是目前認(rèn)為最直接參與新血管生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的途徑。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)具有生長快和轉(zhuǎn)移早的特性，也是一種強(qiáng)的血管依賴性腫瘤。血管生成是其惡性化的第一步，而眾多的促血管生成因子和抗血管生成因子參與了血管生成的過程。因此，以血管生成信號(hào)傳導(dǎo)通路為靶向的抗血管治療可能是一種很有潛力的抗腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的治療方法。但是，在血管生成過程中，許多信號(hào)傳導(dǎo)分子機(jī)制目前

3、還不清楚，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)方法和蛋白印記方法評(píng)估VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2在鼻咽癌中的表達(dá)，目的是探索在鼻咽癌生長及轉(zhuǎn)移中這些促血管生成細(xì)胞因子及受體作用的分子機(jī)理。 方法： 1，對(duì)象：我院和浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年10月至2006年11月鼻內(nèi)窺鏡下切取的23例NPC標(biāo)本，分別切取癌組織23例、癌邊緣(距癌組織1cm以內(nèi))23例和遠(yuǎn)離癌的鼻咽部組織(距癌組織5cm以上)23例，正

4、常鼻咽部組織24例(均為正常人鼻咽部組織)。切取的標(biāo)本即刻放置液氮中冷凍并移置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩１窘M病人年齡26-68(平均50.86±12.78)。所有標(biāo)本均經(jīng)H-E染色，病理證實(shí)臨床均為鼻咽癌診斷，其中鏡下脈管浸潤7例，同時(shí)伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，按1997年UICC分期方法Ⅰ-Ⅱ期18例，Ⅲ-Ⅳ期5例。 2，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)：用Trizol試劑從切除標(biāo)本分離RNA。標(biāo)本稱重、冰凍后用研缽在Trizol試劑中研磨，分光

5、光度儀測(cè)定總RNA濃度。加1μl DNase取出污染的DNA分子。1μg總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)物cDNA 2μl和特異引物Ang-1、Ang-2、 VEGF、KDR、Tie2和內(nèi)參照引物GAPDH進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)。1.5％瓊脂糖膠分離13μlPCR產(chǎn)物，溴化乙腚染色。Koda Digital Science 1S2.0DNA分析軟件系統(tǒng)對(duì)進(jìn)行PCR產(chǎn)物半定量分析。 3，蛋白印跡：樣本在裂解液中勻漿。加入SDS上樣緩沖液煮沸5分鐘

6、。每個(gè)加樣孔上樣量為50μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白(6％膠分離Tie2和KDR，8％膠分離Ang1、Ang2和VEGF)。之后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(1mA/cm 1.5小時(shí))上。麗春紅染色確定蛋白轉(zhuǎn)移的情況，5％脫脂牛奶(TBST配制)封閉PVDF膜1.5小時(shí)，加入-抗4℃過夜；TBST洗膜3×15min，加入二抗(1:1000)孵育1小時(shí)，按上述方法洗膜。加顯影劑ECL，壓片曝光顯影。 4，免疫組織化學(xué)：甲醛固

7、定石蠟包埋標(biāo)本連續(xù)切片，厚約4-6mm，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，抗原修復(fù)。3％過氧化氫5分鐘消除內(nèi)源性過氧化酶活性，10％羊血清封閉非特異抗原結(jié)合位點(diǎn)后，加入鼠抗CD34單克隆抗體(1:25)37.4℃孵育1小時(shí)，按HRP標(biāo)記手冊(cè)操作。選取5個(gè)200×視野進(jìn)行CD34陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。 5，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，RT-PCR吸光度分析和血管密度分析均采用方差分析。SPSS11.0分析軟件進(jìn)行數(shù)

8、據(jù)分析。p<0.05表示存在差異。 結(jié)論： 1、在切取的NPC標(biāo)本中，血管的分布有一定的規(guī)律，癌組織中無壞死部位的血管較為豐富，且分布較為混亂，在腫瘤組織邊緣同樣血管生成較為活躍。 2、內(nèi)皮細(xì)胞特異性的信號(hào)傳導(dǎo)通路，VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2在NPC組織中明顯的活化，推測(cè)共同參與腫瘤血管的生成，兩者缺一不可。 3、上述兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化是不協(xié)調(diào)的，從而導(dǎo)致腫瘤血管在結(jié)構(gòu)和功

9、能上存在明顯的缺陷，更有利于腫瘤細(xì)胞的生長。 4、VEGF、Ang2和Tie2表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤的浸潤性及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 第二部分在體外EGCG抑制內(nèi)皮細(xì)胞304的血管形成的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 腫瘤在其生長過程中可分泌大量的促血管生成因子，但目前發(fā)現(xiàn)的特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的因子包括Vascular endothelial growch factor(VEGF)、Angiopoietins和Ephrin家族，他們

10、與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合而產(chǎn)生促血管生成的作用。VEGF在血管生成方面起著重要的作用，可以增加血管通透性和內(nèi)皮細(xì)胞增生；刺激體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移；對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有抗凋亡作用。目前的研究證實(shí)，這些生物效應(yīng)主要是通過VEGF受體KDR/Flk-1信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的另一酪氨酸激酶受體Tie2參與新生血管的形成并維持血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而保證新生血管可以發(fā)揮正常的生理功能。其配體血管生成素(Angiopoietin)的結(jié)合使得Tie

11、2磷酸化，并且導(dǎo)致其下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin3-O-gallate,EGCG)是茶葉中最重要的成分，具有很多的生物學(xué)效應(yīng)，在許多的實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)得到證實(shí)，諸如防癌抗癌、抗氧化作用、消炎及調(diào)節(jié)免疫作用。在防癌抗癌的作用中，其主要的機(jī)理是激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制某些酶的活性。近十幾年，EGCG抑制腫瘤血管生成的研究已經(jīng)引起許多的學(xué)者的重視，因此，本實(shí)驗(yàn)的主要目

12、的是觀察EGCG對(duì)人NPC細(xì)胞株HNE-1和人內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304增殖的影響，以及對(duì)受體酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用，揭示EGCG抗腫瘤生長及血管生成的分子機(jī)制。 方法： 1、MTT：將融合的培養(yǎng)細(xì)胞HNE-1和ECV304用胰酶消化，吹打散計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×10<'5>，取96孔板，每孔加入細(xì)胞混懸液100ul，同時(shí)給于不同的處理，設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，對(duì)照孔加入常規(guī)培養(yǎng)液。EGCG濃度分別為25uM、50 uM、75

13、uM、100 uM。培養(yǎng)48d,時(shí)后分別加入MTT(10mg/ml)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，加入二甲基亞楓(DMSO)100ul，室溫放置15分鐘，酶標(biāo)儀上檢測(cè)570nm波長的吸光度(OD值)。 2、體外內(nèi)皮細(xì)胞血管樣結(jié)構(gòu)培養(yǎng)試驗(yàn)： 4體積鼠尾型膠原2.5mg/ml，1體積混合液(10xDMEM培養(yǎng)液：0.34N Na<,2>CO<,3>=2:1，1NNaOH調(diào)節(jié)pH至7.3)。取96孔板一塊，每孔加入上述培養(yǎng)液100ul，3

14、7℃5分鐘凝固。調(diào)整ECV304細(xì)胞數(shù)目至1×10<'5>，每孔加入100ul，37℃、5％CO<,2>條件下培養(yǎng)24小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入處理?xiàng)l件不同的培養(yǎng)基。VEGF濃度50ng/ml，HN-1條件培養(yǎng)基(HNE-1 ConditionalMedium，HNE-1 CM)50ul，EGCG濃度分別為25uM、50 uM、75 uM、100 uM。每天觀察細(xì)胞生長情況，每兩天照相一次，共培養(yǎng)8天。 3、RT-PCR：

15、ECV304接種于6孔板，每孔加入細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔，棄取上清，PBS洗滌兩次，分別加入含有EGCG不同濃度的DMEM培養(yǎng)液，EGCG濃度分別為25uM、50 uM，37℃、5％CO<,2>條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入VEGF 50ng.ml和HNE-1 CM 500ul，繼續(xù)培養(yǎng)5分鐘，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞兩次，含0.02％EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞。RT-PCR按照Invitrogen公司One-step RT-P

16、CR試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行操作。 4、免疫沉淀：細(xì)胞培養(yǎng)及收集同3，各加細(xì)胞裂解液100ul，充分裂解。取200ug蛋白，加入抗體KDR或Tie2(濃度2ug/ml)，4℃過夜，免疫沉淀分離抗原按Pierce公司免疫沉淀試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。將含有抗原蛋白洗的脫液體進(jìn)行低溫抽干至剩余40ul時(shí)，加入5×上樣緩沖液20ul(每20ul加5ul)，煮沸5分鐘即可。8％SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳分離后，硝酸銀染色。 5、West

17、ern blot：將上述蛋白進(jìn)行電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5％脫脂奶粉封閉1小時(shí)，加入泛磷酸化抗體p-Tyr(PY99)1:1000，4℃過夜，TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的鼠二抗振蕩后，洗膜同前，ECL顯影。 6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)論： 1、EGCG可以明顯的抑制NPC細(xì)胞HNE-1的生長，而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的影響較小。 2、EGCG在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制內(nèi)皮細(xì)胞受體K