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文檔簡(jiǎn)介
1、第一章 Lnk對(duì)胰島素/IGF-I信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
目的:研究Lnk對(duì)胰島素或IGF1細(xì)胞信號(hào)通路的影響及其作用機(jī)制。
方法:(1)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lnk WT(或和Lnk RE)質(zhì)粒的TOV112D和OVCA420細(xì)胞株。(2)Western blot檢測(cè)100ng/ml人重組IGF1或100 nM人重組胰島素處理前和處理15分鐘后的磷酸化和總AKT、ERK和4EBP1信號(hào)通路蛋白。(3)
2、免疫共沉淀(CoIP)檢測(cè)體外Lnk和IR是否結(jié)合。
結(jié)果:(1)LnkWT抑制的TOV112D和OVCA420中無(wú)Ins處理或Ins反應(yīng)的P13K-AKT和MAPK-ERK信號(hào)通路。(2) Lnk下調(diào)IGF1反應(yīng)的MAPK-ERK但卻上調(diào)PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo),所有狀態(tài)的AKT、4EBP1和ERK總蛋白則沒(méi)有明顯變化。(3) Lnk和IR的結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示,Lnk與IR在體外可以結(jié)合,但是程度中等。
結(jié)論:(
3、1) Lnk可以抑制上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞中PI3K-AKT和MAPK-ERK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。(2)Lnk可以負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素反應(yīng)的PI3K-AKT和MAPK-ERK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),作為胰島素信號(hào)通路的一個(gè)新抑制因子,可能在上皮性卵巢腫瘤以及其他胰島素信號(hào)通路異常相關(guān)性疾病中起作用。(3)Lnk上調(diào)IGF1反應(yīng)的PI3K-AKT通路而下調(diào)MAPK-ERK細(xì)胞信號(hào),Lnk對(duì)上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞中IGF1反應(yīng)的PI3K與ERK1/2通路可能存在相互作用
4、,Lnk對(duì)胰島素和IGF1分別反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路的作用存在差異。(4)Lnk與IR在體外中等結(jié)合。
第二章 Lnk在正常卵巢和卵巢腫瘤中的表達(dá),以及對(duì)其增殖的影響和機(jī)制探討
目的:檢測(cè)Lnk在正常卵巢和上皮性卵巢腫瘤組織,以及人正常卵巢上皮和卵巢上皮性腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá);并研究Lnk對(duì)正常卵巢上皮和上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。
方法:(1)上皮性卵巢腫瘤和正常卵巢組織的石蠟切片標(biāo)本
5、各5例,免疫組化方法檢測(cè)各標(biāo)本中Lnk蛋白的表達(dá)。(2)采用real-time PCR法檢測(cè)多個(gè)上皮性卵巢腫瘤以及正常卵巢上皮細(xì)胞株中Lnk mRNA的表達(dá)。(3) SRB法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LnkWT和/或LnkRE,EV的TOV112D、OVCA420和IOSE144細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)。(4)雙層軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了LNK質(zhì)粒的上述細(xì)胞的克隆形成能力。
結(jié)果:(1)正常卵巢外皮質(zhì)的各期卵泡中皆見(jiàn)Lnk蛋白的表達(dá)。在卵巢上
6、皮性腫瘤中腫瘤組織和間質(zhì)均有的很強(qiáng)的Lnk表達(dá),較正常卵巢明顯增多。(2)Lnk在各個(gè)細(xì)胞株中均有表達(dá)。卵巢上皮性腫瘤細(xì)胞株與人白血病細(xì)胞株中的表達(dá)無(wú)明顯差異。正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE144和IOSE80的表達(dá)較K-562稍低。(3)SRB生長(zhǎng)曲線(xiàn)和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)皆顯示LnkWT抑制TOV112D、OVCA420和IOSE144細(xì)胞增殖,LnkRE與EV比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)論:(1)Lnk在正常卵巢上皮中有較高表
7、達(dá),并可抑制正常卵巢上皮細(xì)胞的增值,提示Lnk可能參與在正常卵巢上皮增殖的調(diào)節(jié)。
(2) Lnk在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)較正常卵巢升高,可抑制上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞的增殖,其作用部位在SH2區(qū)域,提示Lnk可能在上皮性卵巢的形成發(fā)展中起作用。
第三章 LNK基因敲除小鼠和野生型小鼠卵巢的組織學(xué)比較
目的:比較Lnk基因敲除(Lnk-/-)小鼠與Lnk野生型(Lnk WT)小鼠的卵巢組織學(xué)變化,在體內(nèi)
8、實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Lnk對(duì)卵巢發(fā)育的影響。
方法:收集6-8周大的野生型Lnk的C57B L/6小鼠和Lnk-/-129/Sv小鼠的雙側(cè)卵巢各3例,常規(guī)組織切片染色,觀察其組織學(xué)變化。
結(jié)果:Lnk-/-與LnkWT小鼠的閉鎖的卵泡明顯減少。卵巢黃體中,Lnk-/-小鼠的血管較LnkWT小鼠的明顯增多,充血,細(xì)胞稍腫脹。
結(jié)論:提示Lnk可促進(jìn)卵泡閉鎖,對(duì)卵泡的發(fā)育及卵巢激素的分泌可能有影響。
9、> 本研究主要結(jié)論
1.首次發(fā)現(xiàn)Lnk可以負(fù)性調(diào)節(jié)上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞中胰島素反應(yīng)的PI3K-AKT和MAPK-ERK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。
2.發(fā)現(xiàn)Lnk可以下調(diào)上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞中IGF1反應(yīng)的MAPK-ERK,但卻上調(diào)PI3K-AKT細(xì)胞信號(hào)通路,提示Lnk對(duì)IGF1反應(yīng)的PI3K與ERK1/2通路可能存在相互作用;Lnk對(duì)胰島素和IGF1分別反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路的作用存在差異。
3.首次發(fā)現(xiàn)L
10、nk在人類(lèi)正常卵巢中有較高表達(dá),并可抑制正常卵巢上皮細(xì)胞的增殖,而且Lnk-/-小鼠中凋亡卵泡減少,卵巢黃體中血管增多,充血明顯,提示Lnk可能參與在正常卵巢上皮增殖和卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié),對(duì)及卵巢激素的分泌也可能有影響。
4.首次發(fā)現(xiàn)Lnk在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)較正常卵巢明顯升高;而且Lnk可抑制上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞中P13K-AKT和MAPK-ERK的信號(hào)傳導(dǎo)通路以及細(xì)胞增殖,提示Lnk可能通過(guò)影響細(xì)胞信號(hào)通路,在上皮性卵巢
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