水通道蛋白在卵巢上皮性癌中的作用及其調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、卵巢上皮性癌(簡稱卵巢癌)由于病因及發(fā)病機制不明，發(fā)病隱匿，70％以上的卵巢癌患者就診時已屆晚期，治療效果欠佳，積極開展卵巢癌病因?qū)W及發(fā)病機制研究的意義重大。 細胞內(nèi)外水平衡是維持生命的關(guān)鍵因素之一，水的跨膜轉(zhuǎn)運對維持細胞正常代謝具有重要作用。水通道蛋白家族(AQPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的選擇性轉(zhuǎn)運水的跨膜蛋白，廣泛分布于機體組織細胞，參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外的平衡。卵巢癌合并腹水是晚期病人的一大臨床表現(xiàn)，是否存在水代謝方面的障礙

2、尚不清楚，目前尚未見水通道蛋白與卵巢癌關(guān)系的報道。 水通道蛋白AQP1分布廣泛，不僅存在于分泌及吸收上皮細胞，毛細血管及小血管內(nèi)皮細胞中也很豐富，AQP1蛋白表達與毛細血管的通透性有關(guān)。AQP5主要表達于哺乳動物唾液腺、呼吸道黏膜和消化腺等腺體細胞的頂漿膜，在腺體分泌中有不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)敲除AQP1基因的小鼠肺泡-毛細血管水的交換明顯減少，微血管內(nèi)皮細胞對水的通透性下降了十倍，AQP5基因敲除小鼠肺內(nèi)滲透壓依賴的被動性水

3、轉(zhuǎn)運被抑制90％。最近研究證明水通道蛋白過表達與結(jié)腸癌的發(fā)生及神經(jīng)膠質(zhì)瘤腦水腫有關(guān)。 NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種細胞中，可與相關(guān)基因啟動子或增強子特殊DNA序列結(jié)合，調(diào)控多種基因表達，與腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。目前已有學(xué)者在AQP5的開放閱讀窗上游找到NF-κB啟動序列，NF-κB在卵巢癌中是持續(xù)性活化的，但核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是否調(diào)控卵巢癌細胞AQP5蛋白的表達尚不清楚。 為明確水通道蛋白AQP

4、1和AQP5在卵巢癌中的作用及其調(diào)節(jié)機制，本文利用細胞培養(yǎng)、免疫組化、蛋白免疫印跡和PT-PCR技術(shù)從兩個方面進行研究：1.水通道蛋白AQP1和AQP5在卵巢上皮性癌中的表達及其臨床意義；2.卵巢癌SKOV3細胞AQP5蛋白表達的調(diào)節(jié)機制研究。 第一部分AQP1和AQP5蛋白在卵巢上皮性癌的表達及其臨床意義方法：采用免疫組化、蛋白免疫印跡和RT-PCR技術(shù)檢測65例卵巢上皮性腫瘤組織中AQP1和AQP5蛋白及mRNA的表達，并以

5、13例正常卵巢組織為對照。結(jié)果：1.AQP1蛋白主要表達于卵巢上皮性腫瘤和正常卵巢組織的毛細血管和小血管內(nèi)皮細胞的細胞膜上；AQP5主要表達于良性腫瘤細胞的基底膜，交界性腫瘤細胞的基底膜和頂漿膜，彌漫分布于卵巢癌細胞的胞膜上，在卵巢扁平上皮無表達或弱表達。2.卵巢癌及卵巢交界性上皮性腫瘤組織中AQP1和AQP5蛋白及mRNA表達水平明顯高于卵巢良性上皮性腫瘤及正常卵巢組織(P＜0.05)；而卵巢癌與卵巢交界性上皮性腫瘤間、卵巢良性上皮性

6、腫瘤與正常卵巢組織間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。3.卵巢癌腹水量≥1000ml者AQP1和AQP5蛋白和mRNA表達明顯高于腹水量＜500ml者(P＜0.05)，伴淋巴轉(zhuǎn)移者AQP5蛋白水平明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。4.Person相關(guān)分析顯示：AQP1蛋白和mRNA表達與卵巢癌腹水量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.423，0.429；P＜0.05，P＜0.05)；AQP5蛋白和mRNA表達水平與卵巢癌腹水量(r=0.441，

7、0.427；P＜0.01，P＜0.05)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.410，0.361；P＜0.05，P＜0.05)。 第二部分卵巢癌SKOV3細胞AQP5蛋白表達調(diào)節(jié)機制的研究方法：采用細胞培養(yǎng)、MTT、免疫組化和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測卵巢癌腹水、順鉑以及核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑PDTC對卵巢癌細胞株SKOV3生長狀況、AQP5和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65以及其抑制因子IκBα蛋白表達的影響。 第一節(jié)卵巢癌腹水對SKOV

8、3細胞AQP5、NF-κBp65和IκBα蛋白表達的影響結(jié)果：1.隨著所取囊液或腹水來自卵巢腫瘤惡性程度的升高，SKOV3細胞生長率也明顯增加，惡性組明顯高于交界組(P＜0.001)，交界組明顯高于良性組(P＜0.001)和對照組(P＜0.01)。2.惡性組NF-κBp65核/漿蛋白比值和胞漿NF-κBp65/IκBα蛋白比值明顯高于對照組、良性組及交界組(P＜0.05)，但對照組、良性組和交界組三組間無顯著差異(P＞0.05)。3.卵

9、巢癌腹水培養(yǎng)的SKOV3細胞AQP5蛋白表達高于良性組和對照組(P＜0.05)，交界組明顯高于良性組(P＜0.01)，對照組高于良性組(P＜0.05)。4.Person相關(guān)分析顯示：SKOV3細胞生長率與AQP5蛋白表達、NF-κBp65核/漿蛋白比值和胞漿NF-κBp65/IκBα蛋白比值有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.926，0.878，0.839；P＜0.001，0.001，0.01)；AQP5蛋白表達與NF-κBp65核/漿蛋白比值

10、和胞漿p65/IκBα蛋白比值呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.658，0.622；P＜0.05，0.05)；NF-κBp65蛋白表達與IκBα有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.839，P＜0.01)。 第二節(jié)順鉑對SKOV3細胞AQP5、NF-κBp65和IκBα蛋白表達的影響結(jié)果：1.隨著順鉑劑量增加、作用時間延長，SKOV3細胞邊緣變鈍、變圓，突觸減少，與鄰近細胞脫離；SKOV3細胞生長抑制率也逐漸增加，且有時間及劑量依從性(P＜0.

11、01)。2.隨著順鉑濃度增加、作用時間延長，SKOV3細胞AQP5蛋白表達量越來越少(P＜0.001)，并可見AQP5蛋白表達于核膜上。3.隨著順鉑濃度增加、作用時間延長，細胞漿和細胞核內(nèi)NF-κBp65和IκBα蛋白表達越少(P＜0.001)，p65核/漿蛋白比值也明顯下降(P＜0.001)。4.Person相關(guān)分析顯示：順鉑對SKOV3細胞生長抑制率與AQP5、胞漿和胞核NF-κBp65蛋白表達以及p65核/漿蛋白比值有明顯的負相關(guān)

12、關(guān)系(r=-0.598，-0.835，-0.710，-0.815；P＜0.01，0.001，0.01，0.001)；AQP5蛋白表達與細胞漿NF-κBp65、IκBα以及p65核/漿蛋白比值呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.894，0.857，0.883；P＜0.001，0.001，0.001)；NF-κBp65蛋白表達與IκBα有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.934；P＜0.001)。 第三節(jié)PDTC對SKOV3細胞AQP5、NF-κBp

13、65以及IκBα蛋白表達的影響結(jié)果：1.隨著PDTC濃度增高、作用時間延長，對SKOV3細胞生長抑制率越來越高(P＜0.001)，且有時間及劑量依從性。2.隨著PDTC濃度增加、作用時間延長，SKOV3細胞漿和胞核NF-κBp65和IκBα蛋白表達均明顯減少(P＜0.001)。3.隨著PDTC終濃度增加，作用時間延長，SKOV3細胞AQP5蛋白表達逐漸減少(P＜0.001)。4.Person相關(guān)分析顯示：PDTC對SKOV3細胞生長抑制

14、率與AQP5、細胞漿和胞核NF-κBp65蛋白表達呈明顯的負相關(guān)關(guān)系(r=-0.983，-0.716，-0.744；P＜0.001，0.01，0.01)；AQP5蛋白表達與胞漿和胞核NF-κBp65以及胞漿IκBα呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.668，0.625，0.675；P＜0.05，0.05，0.05)，胞漿NF-κBp65與IκBα蛋白表達有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.939；P＜0.001)。 結(jié)論：1.AQP1和AQP5

15、蛋白定位于卵巢腫瘤組織中的不同細胞，前者位于微血管及小血管內(nèi)皮細胞，后者位于卵巢腫瘤細胞，說明兩者介導(dǎo)卵巢腫瘤組織中不同細胞的水跨膜轉(zhuǎn)運。 2.卵巢癌組織中AQP1和AQP5蛋白表達上調(diào)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。 3.卵巢癌微血管內(nèi)皮AQP1和癌細胞AQP5蛋白表達上調(diào)，可能是卵巢癌腹水產(chǎn)生的原因之一。 4.卵巢癌腹水可激活SKOV3細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，上調(diào)AQP5蛋白表達，促進細胞生長。

16、 5.順鉑作用早期，可激活SKOV3細胞NF-κB，因此化療時應(yīng)注意藥物劑量和用藥時間，以防產(chǎn)生耐藥。 6.順鉑作用晚期，可抑制SKOV3細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，下調(diào)AQP5蛋白表達，抑制細胞生長。 7.核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑PDTC下調(diào)SKOV3細胞NF-κBp65及IκBα蛋白表達，減少NF-κBp65蛋白核移位，抑制細胞增殖。 8.SKOV3細胞漿和細胞核NF-κBp65和IκBα蛋白表達是同步的，兩者相互依存