卵巢上皮性癌移植瘤中休眠細(xì)胞的干細(xì)胞屬性和啟動增殖機(jī)制的探討.pdf

1、卵巢上皮性癌（簡稱卵巢癌）占卵巢惡性腫瘤的90％，是生殖道惡性腫瘤中死亡率最高的疾病。目前，大部分卵巢癌患者經(jīng)過徹底的細(xì)胞減滅術(shù)和術(shù)后含鉑類藥物的聯(lián)合化療后，雖有相當(dāng)長的完全緩解期，但仍有70％患者在幾年或者十幾年內(nèi)復(fù)發(fā)。這一臨床現(xiàn)象可以用腫瘤休眠解釋，腫瘤休眠是指宿主免疫與靜止殘余瘤之間的一種亞臨床平衡狀態(tài)，也可理解為微小的殘留病灶，休眠的腫瘤細(xì)胞長期存在是惡性腫瘤難以徹底根治的主要原因。越來越多的研究表明，腫瘤休眠與腫瘤干細(xì)胞(ca

2、ncer stem cells，CSCs)密切相關(guān)。雖然尚未明確這些具有不同的表型和異質(zhì)性的CSCs是腫瘤的惡性根源，但是這些具有成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)特性的CSCs可以解釋腫瘤細(xì)胞的休眠，比如CSCs同ASCs一樣潛伏于壁龕中處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，可以躲避藥物的殺傷繼續(xù)存活而成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。因此，學(xué)者們推測CSCs在某種調(diào)節(jié)因素作用下發(fā)生了休眠—增殖狀態(tài)的功能轉(zhuǎn)換、重新進(jìn)入增殖期，從而導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)。

3、
　　 胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor, IGF）是體內(nèi)強(qiáng)有力調(diào)控生長和代謝的因子，而IGF需要通過胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)的介導(dǎo)發(fā)揮其功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、分化及凋亡等等。研究表明IGF、IGF-1R與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。IGF-1R是一種異源二聚體跨膜蛋白酪氨酸激酶，與其配體IGF-1和IGF-2結(jié)合后發(fā)生磷酸化反應(yīng)，啟動信號傳遞鏈，尤其是PI3

4、K/AKT通路，從而不僅在正常細(xì)胞的增殖、凋亡和機(jī)體生長發(fā)育，而且在惡性腫瘤細(xì)胞增殖和對抗凋亡起著關(guān)鍵的作用。100％的卵巢上皮性癌組織和多數(shù)卵巢癌細(xì)胞系表達(dá)IGF-1R，IGF信號通路與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，與化療耐藥也密切相關(guān)，IGF-1R高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。因此，IGF家族是否與休眠的腫瘤細(xì)胞逸出靜止期重新進(jìn)入增殖期有關(guān)值得關(guān)注。
　　 本研究我們擬采用卵巢癌細(xì)胞系SKO

5、V3建立裸鼠移植瘤模型，研究熒光高保留的PKH26hi細(xì)胞克?。葱菝叩幕蛱幱诰徛芷诘穆殉舶┘?xì)胞）的“干性”，并對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3建立裸鼠移植瘤模型進(jìn)行化療，觀察順鉑(DDP)對休眠的PKH26hi細(xì)胞的干細(xì)胞屬性的影響。隨后，以卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠移植瘤順鉑化療后瘤細(xì)胞懸液為研究對象，從中分選出的具有干細(xì)胞屬性的休眠的SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞，應(yīng)用IGF-1R抑制劑NVP，觀察IGF受體通路在調(diào)控SKOV3-R-

6、PKH26hi細(xì)胞逸出靜止期的作用以及抑制IGF受體通路后SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖和凋亡的變化，探討IGF受體通路與休眠細(xì)胞啟動增殖的相關(guān)性。
　　 第一部分卵巢上皮性癌移植瘤中休眠細(xì)胞的干細(xì)胞屬性分析
　　 目的:腫瘤休眠不僅是惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源之一。本部分研究旨在探討卵巢癌移植瘤中休眠的腫瘤細(xì)胞是否具有干細(xì)胞屬性，順鉑(DDP)對休眠的腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞屬性的影響。<

7、br>　　 方法:
　　 1、應(yīng)用PKH26熒光試劑盒標(biāo)記SKOV3細(xì)胞
　　 2、應(yīng)用卵巢癌細(xì)胞SKOV3建立裸鼠異種移植瘤模型
　　 將PKH26標(biāo)記的SKOV3細(xì)胞1×107個，0.5ml PBS重懸，接種于雌性裸鼠左側(cè)的大腿皮下，建立卵巢癌皮下異種移植瘤模型。大約兩周后，當(dāng)移植瘤體積大于100mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為兩組即對照組和治療組，治療組給予DDP（4mg/kg）腹腔注射治療，每周2次，連續(xù)3周，

8、停藥后觀察腫瘤大小。當(dāng)對照組移植瘤體積大于1500mm3或化療結(jié)束后移植瘤體積維持在一定大小不再生長時實驗終止。本實驗中，我們將對照組的移植瘤命名為SKOV3-P腫瘤，治療組的移植瘤命名為SKOV3-R腫瘤。
　　 3、觀察移植瘤生長和化療的副反應(yīng)
　　 每天觀察裸鼠的一般情況，每6天測量并記錄裸鼠的體重及移植瘤的體積。在實驗過程中，密切觀察化療對裸鼠的副反應(yīng)，包括體重的下降、行為和飲食的該變以及皮膚顏色的改變。

9、　　 4、細(xì)胞增殖狀態(tài)的分選
　　 根據(jù)PKH26熒光保留的強(qiáng)度，將PKH26標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞可以劃分為3群:高保留細(xì)胞群（PKH26hi細(xì)胞）、低保留細(xì)胞群（PKH26low細(xì)胞）和熒光完全淬滅細(xì)胞群（PKH26neg細(xì)胞）。SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中的PKH26hi、PKH26low、PKU26neg三群細(xì)胞根據(jù)各自的熒光強(qiáng)度分別采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行分選。
　　 5、FCM檢測從SKOV3-P和SK

10、OV3-R腫瘤中分選出的PKH26hi、PKH26low、PKH26neg細(xì)胞的周期分布。
　　 6、采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法分析SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中分選出的PKH26hi、PKH26low、PKH26neg細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、Oct3/4、CD117的表達(dá)水平。
　　 7、采用FCM方法檢測SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中分選出的PKH26hi、PKH26l

11、ow、PKU26neg細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、Oct3/4、CD117的蛋白表達(dá)水平。
　　 8、采用體外克隆形成實驗檢測SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中分選出的PKH26hi、PKH26low、PKH26neg細(xì)胞的克隆形成率。
　　 9、采用體內(nèi)裸鼠體內(nèi)成瘤能力實驗檢測SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中分選出的PKH26hi、PKH26low、PKH26neg細(xì)胞的腫瘤形成率。
　　 結(jié)果:

12、>　　 1、PKH26熒光標(biāo)記試劑盒對SKOV3細(xì)胞標(biāo)記的特征
　　 PKH26標(biāo)記的SKOV3細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)紅色，染色效率可達(dá)100％，染料在細(xì)胞膜上分布均勻一致。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中傳代后，紅色熒光可隨著細(xì)胞的貼壁生長而逐漸減弱。
　　 2、各組裸鼠移植瘤的生長和一般狀況的評估
　　 給予裸鼠DDP治療1周后（即第14天到21天），治療組移植瘤的平均生長速度低于對照組，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0

13、.05);從第14天到第35天（DDP治療結(jié)束），DDP能夠顯著抑制移植瘤的生長，延緩腫瘤生長速度。第14天到28天，治療組裸鼠移植瘤的平均生長速度為對照組1/3(P＜0.05);第28天到35天，治療組裸鼠移植瘤的平均生長速度僅為對照組1/5（P＜0.05），第35天，治療組裸鼠移植瘤的平均體積顯著小于對照組（P＜0.05）。DDP治療結(jié)束后一周（第42天），治療組裸鼠移植瘤普遍較小，與治療結(jié)束時（第35天）裸鼠移植瘤體積比較，差異無

14、統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與對照組比較其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 與對照組比較，治療組裸鼠經(jīng)過DDP治療后出現(xiàn)了一系列副反應(yīng)，包括體重減輕（P＜0.05）、短時間的嗜睡、輕微的皮膚褪色、飲食的減退（P＜0.05）、白細(xì)胞減少（P＜0.05）。盡管化療引起一系列副反應(yīng)，但是根據(jù)化療副反應(yīng)的分級，治療組裸鼠化療副反應(yīng)為Ⅰ級，表明裸鼠能夠一定程度的耐受化療。
　　 3、裸鼠移植瘤中存在休眠的PKH26hi細(xì)

15、胞且DDP可以使休眠的PKH26hi細(xì)胞富集
　　 PKH26hi細(xì)胞在SKOV3-R腫瘤中所占比率(7.57％)顯著高于其在SKOV3-P腫瘤中所占比率(2.89％，P=0.003)，同時，PKH26low細(xì)胞在SKOV3-R腫瘤中所占比率(70.94％)也顯著高于其在SKOV3-P腫瘤中所占比率（48.87％，P=0.002），然而PKH26neg細(xì)胞在SKOV3-R腫瘤中所占比率(20.58％)卻顯著低于其在SKOV3-P

16、腫瘤中所占比率(46.97％，P=0.002)。
　　 4、DDP對卵巢癌細(xì)胞周期分布的影響
　　 SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中PKH26hi細(xì)胞均處于G0/G1期，進(jìn)一步證實PKH26hi細(xì)胞代表熒光高保留的、休眠的或處于緩慢周期的細(xì)胞。
　　 SKOV3-P腫瘤中PKH26low細(xì)胞大部分處于G0/G1期。與SKOV3-P腫瘤中PKH26low細(xì)胞相比較，SKOV3-R腫瘤中PKH26low細(xì)胞的S期

17、細(xì)胞顯著增多而G2/M期細(xì)胞顯著減少（均P＜0.05）。
　　 SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中PKH26neg細(xì)胞與PKH26low細(xì)胞比較，PKH26neg細(xì)胞中S期細(xì)胞增多（P=0.004和P=0.001）;與SKOV3-P腫瘤中PKH26neg細(xì)胞相比，SKOV3-R腫瘤中PKH26neg細(xì)胞中處于G0/G1期細(xì)胞減少，S和G2/M期細(xì)胞增多（P=0.2，P=0.001和P=0.47）。
　　 5、休眠的PK

18、H26hi細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物且DDP可以增強(qiáng)其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)
　　 Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、Oct3/4和CD117在SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中PKH26hi細(xì)胞的表達(dá)均顯著高于PKH26low細(xì)胞(P＜0.05)，PKH26neg細(xì)胞均不表達(dá)這三種干細(xì)胞標(biāo)記物。SKOV3-R腫瘤中PKH26hi細(xì)胞的Nestin、Oct3/4和CD117 mRNA的表達(dá)顯著高于SKO

19、V3-P腫瘤中PKH26hi細(xì)胞的表達(dá)(P=0.024，P=0.045和P=0.022)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、Oct3/4和CD117蛋白在SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中PKH26hi細(xì)胞的表達(dá)均顯著高于PKH26low細(xì)胞（P＜0.05），PKH26neg細(xì)胞均不表達(dá)這三種干細(xì)胞標(biāo)記物;SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞Nestin、Oct3/4和CD117蛋白的表達(dá)顯著高于SKOV3

20、-P-PKH26hi細(xì)胞（P=0.04, P=0.037和P=0.001）。
　　 6、休眠的PKH26hi細(xì)胞顯示克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力且DDP可以增強(qiáng)這種干細(xì)胞樣特性
　　 體外克隆形成實驗結(jié)果顯示，在SKOV3-P腫瘤中，PKH26hi和PKH26low細(xì)胞均具有克隆形成能力，且PKH26hi細(xì)胞的克隆形成率顯著高于PKH26low細(xì)胞（t=11.029，P=0.001）。同樣，在SKOV3-R腫瘤中PKH26

21、hi細(xì)胞的克隆形成率顯著高于PKH26low細(xì)胞（t=13.81，P=0.000）。SKOV3-R腫瘤中PKH26hi細(xì)胞的克隆形成率顯著高于SKOV3-P腫瘤中的PKH26hi細(xì)胞（t=4.467，P=0.011），同樣的差異也存在于PKH26low細(xì)胞克隆形成率的比較（t=4.35，P=0.012）。
　　 體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果表明，在SKOV3-P腫瘤中，兩個細(xì)胞濃度接種裸鼠后，PKH26hi細(xì)胞均可在裸鼠體內(nèi)成瘤，成瘤率分別

22、為50％和83％;PKH26low和PKH26neg細(xì)胞均未顯示體內(nèi)成瘤能力。在SKOV3-R腫瘤中，PKH26hi細(xì)胞在接種的兩個細(xì)胞濃度均顯示了較強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力，成瘤率分別為83％和100％; PKH26low細(xì)胞能夠在體內(nèi)成瘤的細(xì)胞濃度為20，000 cells/ml，成瘤率為33％，而PKH26neg細(xì)胞在接種的兩個細(xì)胞濃度均未顯示體內(nèi)成瘤能力。與SKOV3-P-PKH26hi細(xì)胞相比， SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞顯示

23、了較高的體內(nèi)成瘤能力。同樣，SKOV3-R-PKH26low細(xì)胞與SKOV3-P-PKH26low細(xì)胞相比，也顯示了較高的體內(nèi)成瘤能力。
　　 結(jié)論:
　　 1、卵巢癌SKOV3細(xì)胞建立裸鼠異種移植瘤中存在不同的細(xì)胞克?。≒KH26hi，PKH26low，and PKH26neg細(xì)胞），這些細(xì)胞克隆呈現(xiàn)不同的增殖狀態(tài)、細(xì)胞周期分布和干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平。
　　 2、SKOV3-P和SKOV3-R腫瘤中的PKH2

24、6hi細(xì)胞代表休眠的或處于緩慢周期的細(xì)胞并且具有干細(xì)胞樣特性。
　　 3、化療不僅可以引起PKH26hi細(xì)胞的富集而且有可能增強(qiáng)SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的“干性”。
　　 第二部分胰島素樣生長因子受體通路對卵巢上皮性癌移植瘤中休眠細(xì)胞啟動增殖的調(diào)控
　　 目的:觀察IGF受體通路在調(diào)控SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞逸出靜止期的作用，探討IGF受體通路與休眠腫瘤細(xì)胞啟動增殖的相關(guān)性。
　　 方

25、法:本部分實驗以第一部分人卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠移植瘤順鉑化療后瘤細(xì)胞懸液為研究對象，從中分選出具有干細(xì)胞樣屬性的高保留PKH26細(xì)胞亞群（即SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞）。
　　 1、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中IGF-1、IGF-2和IGF-1R蛋白的表達(dá)。
　　 2、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定無血清培養(yǎng)2

26、4h，48h和72h的SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的培養(yǎng)液中IGF-1和IGF-2蛋白的濃度。
　　 3、細(xì)胞計數(shù)和MTT法測定加入不同濃度外源性IGF-1蛋白(10 ng/ml、30 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)24h，48h和72h后SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表達(dá)。
　

27、　 5、應(yīng)用Western blot方法檢測SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中PI3K/AKT通路的激活及Cyclin B1的表達(dá)
　　 6、SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞培養(yǎng)24h，48h和72h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同培養(yǎng)時間下SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 1、SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中IGF-1、IGF-2和IGF-1R蛋白的表達(dá)
　　

28、 免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示，SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，說明SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞均可以表達(dá)IGF-1、IGF-2和IGF-1R蛋白。
　　 2、SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的培養(yǎng)液中IGF-1和IGF-2蛋白的濃度
　　 ELISA結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞24h后，培養(yǎng)液中IGF-1蛋白的濃度為（49.91±1.24）ng/ml，I

29、GF-2蛋白的濃度為(93.21±2.35)ng/ml;培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)液中IGF-1和IGF-2蛋白的濃度較24h顯著升高（P＜0.05），IGF-1蛋白的濃度為（78.29±1.02）ng/ml，IGF-2蛋白的濃度為（160.39±1.88）ng/ml;培養(yǎng)72h后，IGF-1蛋白的濃度為(105.92±6.09)ng/ml，IGF-2蛋白的濃度為（190.52±3.17）ng/ml，與24h和48h比較培養(yǎng)液中IGF-1和IG

30、F-2蛋白的濃度顯著升高(P＜0.05)。
　　 3、外源性IGF-1蛋白對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響
　　 通過細(xì)胞計數(shù)和MTT實驗的結(jié)果，提示低濃度的IGF-1對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞即能發(fā)揮促增殖作用，隨著IGF-1濃度的增高，對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的促增殖作用也增強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 4、SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中IGF-1R和Ki

31、-67蛋白的表達(dá)
　　 流式細(xì)胞術(shù)方法檢測到SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表達(dá)量隨著培養(yǎng)時間的延長而顯著增高（均P＜0.01）。
　　 5、PI3K/AKT信號通路的檢測
　　 Western blot結(jié)果顯示，SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中p-AKT、p-GSK3β的表達(dá)水平隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著提高（均P＜0.05）。
　　 6、SKOV3-R-PKH26h

32、i細(xì)胞中Cyclin B1蛋白的表達(dá)
　　 Western blot方法檢測Cyclin B1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與培養(yǎng)24h比較，培養(yǎng)48h和72h后SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中Cyclin B1蛋白的表達(dá)量顯著增高（均P＜0.05）;培養(yǎng)72h后Cyclin B1蛋白的表達(dá)量高于培養(yǎng)48h，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 7、SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率
　　

33、細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的增加，SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞顯著減少(P＜0.05)，S期細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），G2/M期細(xì)胞顯著較少(P＜0.05)。
　　 細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞在24h，48h，72h后的細(xì)胞凋亡率分別為（0.233±0.25）％，（0.253±0.30）％，（0.247±0.15）％，未呈現(xiàn)凋亡趨勢，且不同時間點的凋亡率差異均無統(tǒng)

34、計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、IGF-1、IGF-2和IGF-1R在SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中均有表達(dá)，且隨著培養(yǎng)時間的延長，IGF-1、IGF-2的濃度和IGF-1R蛋白的表達(dá)顯著增加，提示SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞存在IGF自分泌。
　　 2、IGF-1R通過活化PI3K/AKT信號通路能夠使Cyclin B1蛋白過表達(dá)，促進(jìn)G2/M期轉(zhuǎn)換啟動SKOV3-R-PKH26

35、hi細(xì)胞的增殖，并可以減少SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的凋亡，提示IGF受體通路能夠調(diào)控卵巢癌休眠細(xì)胞的增殖。
　　 第三部分抑制胰島素樣生長因子受體通路對卵巢上皮性癌移植瘤中休眠細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:應(yīng)用IGF-1R抑制劑NVP，觀察抑制IGF-1R后SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖和凋亡的變化，進(jìn)一步探討IGF受體通路在調(diào)控卵巢癌移植瘤中休眠細(xì)胞啟動增殖方面的作用，并為卵巢癌的治療尋找新的途徑

36、。
　　 方法:本部分實驗以卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠移植瘤順鉑化療后瘤細(xì)胞懸液為研究對象，從中分選出具有干細(xì)胞屬性的高保留PKH26細(xì)胞亞群（即SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞）。
　　 1、應(yīng)用MTT法檢測，加入不同濃度NVP（0μM、1μM、5μM、10μM、15μM），培養(yǎng)48小時，檢測NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響。
　　 2、應(yīng)用MTT法檢測，不同濃度NVP（0μM、1μM、5μ

37、M、10μM、15μM）聯(lián)合IGF-1蛋白（40ng/ml），培養(yǎng)48小時，檢測對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響。
　　 3、將SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞分為對照組和NVP處理組，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測NVP作用后SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表達(dá)。
　　 4、將SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞分為對照組和NVP處理組，培養(yǎng)48h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測NVP處理后S

38、KOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的周期和凋亡率。
　　 5、應(yīng)用MTT法檢測，應(yīng)用NVP(15μM)聯(lián)合不同濃度的順鉑(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，培養(yǎng)48小時，分別檢測對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響。
　　 6、Western blot方法檢測抑制IGF受體通路后下游PI3K/AKT下游蛋白的表達(dá)
　　 7、體外克隆形成能力實驗檢測NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞體

39、外克隆形成能力的影響。
　　 8、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響
　　 MTT法結(jié)果顯示不同濃度NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且隨濃度的增加及作用時間的延長，增殖抑制率相應(yīng)增加，提示這種作用在一定范圍內(nèi)具有時間-劑量依賴性。NVP濃度為15μM時

40、對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的增殖抑制最明顯，因此選擇15μM進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　 2、NVP聯(lián)合IGF-1對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的影響
　　 不同濃度NVP聯(lián)合IGF-1蛋白(40ng/ml)作用SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞后，SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的存活率與單用NVP時的細(xì)胞存活率比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　 3、NVP作用后SKOV3-R-P

41、KH26hi細(xì)胞中IGF-1R和Ki-67蛋白的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測到NVP（15μM）作用SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞后IGF-1R和Ki-67蛋白的表達(dá)量較對照組細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)。
　　 4、NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的周期和細(xì)胞凋亡率的影響NVP作用SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞顯著減少(P＜0.05)，而S期和G2/M期細(xì)胞顯著增多（均P＜0.05），提示NVP

42、可以抑制SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的增殖。
　　 流式細(xì)胞術(shù)方法檢測到NVP作用SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率較對照組顯著增加（17.44±1.14％ vs.0.25±1.76％，P＜0.01），提示NVP可以促進(jìn)SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的凋亡。
　　 5、NVP聯(lián)合DDP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞增殖的抑制作用
　　 NVP聯(lián)合DDP可以顯著的增加DDP對SKOV3-

43、R-PKH26hi細(xì)胞增殖的抑制作用，與單用DDP組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示NVP可以增加SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞對DDP的敏感性。
　　 6、NVP可以引起PI3K/AKT通路的失活
　　 Western blotting結(jié)果顯示:NVP可以顯著降低p-AKT蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，其下游的關(guān)鍵蛋白p-GSK3β、Cyclin B1、Bcl-xL的表達(dá)也顯著降低(P＜0.05)，Ba

44、x蛋白的表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，而總的AKT、GSK3β蛋白的表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)。
　　 7、NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞體外克隆形成能力的影響
　　 NVP可以降低SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞體外克隆形成能力，體外克隆形成實驗結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的克隆形成率為（42.2±1.8）％，NVP作用SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞后，其克隆形成率為（23.6±2.3）％，兩組之

45、間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 8、NVP對SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響
　　 NVP可以降低SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力，對照組裸鼠移植瘤的成瘤率為100％(6/6)，實驗組裸鼠移植瘤的成瘤率為16.7％(1/6)，兩組成瘤率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)。
　　 實驗組裸鼠的體重與對照組相比（19.95±0.99g vs.20.6±0.86g），差

46、異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），裸鼠一般狀況良好，飲食及活動正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。4周后處死裸鼠，各器官均未發(fā)現(xiàn)肉眼的病理改變，取心、肝、肺、腸做病理學(xué)HE染色，均未見明顯病理改變。
　　 結(jié)論:
　　 1、NVP作用后，SKOV3-R-PKH26hi細(xì)胞的增殖活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率和DDP敏感性顯著增高，并可以顯著降低PI3K/AKT下游細(xì)胞周期蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)，提示抑制IGF-1R可以使PI3K/AKT