洛鉑及IL-2聯(lián)合干預(yù)對乳腺癌細胞Syk、C-myc及p53表達及其作用機制研究.pdf

1、目的：乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害廣大女性的身心健康。洛鉑是第三代鉑類抗癌藥物，其抗癌治療指數(shù)高于順鉑和卡鉑，對一部分順鉑和卡鉑耐藥的腫瘤患者有效，且毒副作用比順鉑、卡鉑等藥物均低。目前，洛鉑常被用于治療乳腺癌和小細胞肺癌等，但作用機制尚不十分清楚。IL-2作為增強機體免疫功能的藥物，能促進淋巴細胞增殖，促進免疫細胞殺傷腫瘤細胞。洛鉑和IL-2聯(lián)合用藥是臨床治療乳腺癌的一個新方案。但IL-2對體外培養(yǎng)腫瘤細胞的作用研究還不多，

2、結(jié)論不明確。本研究探討了IL-2、洛鉑以及洛鉑和IL-2聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231體外增殖的抑制作用，以及對乳腺癌細胞內(nèi)p53、syk和c-myc基因表達的影響。
　　 方法：
　　 1細胞株及其培養(yǎng)人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231用含10％胎牛血清、100mg/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2細胞增殖試驗取

3、對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細胞作為實驗對象，分別設(shè)實驗組如下，不同濃度洛鉑（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/ml）、IL-2（3125、6250、12500、25000、50000、100000IU/ml）、IL-2（25000IU/ml）聯(lián)合不同濃度洛鉑（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/ml），計算不同劑量藥物對細胞的增殖抑制率。
　　 3細胞形態(tài)學(xué)變化取對

4、數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細胞作實驗對象，分別設(shè)實驗組如下，不同濃度洛鉑（1.25、5.00、10.00μg/ml）、IL-2（25000、100000IU/ml）和IL-2（25000IU/ml）聯(lián)合不同濃度洛鉑（1.25、5.00、10.00μg/ml），以及對照組，把不同實驗組或?qū)φ战M的細胞經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
　　 4細胞凋亡的檢測收集經(jīng)不同濃度洛鉑（1.25、5.00、1

5、0.00μg/ml）、IL-2（25000、50000、100000IU/ml）和IL-2（25000IU/ml）聯(lián)合不同濃度洛鉑（1.25、5.00、10.00μg/ml）作用24小時的MCF-7和MDA-MB-231細胞，PBS緩沖液洗滌細胞3次，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，流式細胞儀檢測，Single histogram statistic軟件分析細胞凋亡率。
　　 5半定量RT-PCR技術(shù)檢測MCF-7和MDA-MB

6、-231細胞syk、p53、c-myc mRNA表達MCF-7和MDA-MB-231細胞分別經(jīng)不同濃度洛鉑、IL-2和IL-2聯(lián)合不同濃度洛鉑（濃度分組同上4）作用24小時，用Trizol試劑法提取細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），分析Syk、p53、c-myc、β-actin mRNA表達。
　　 6統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以x±s表示，兩個獨立樣本組間均數(shù)比較用t

7、檢驗，多組的組間比較用方差分析，p<0.05表示差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1洛鉑對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖有明顯抑制作用當(dāng)濃度范圍在1.25～20.00μg/ml時，洛鉑能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞體外增殖反應(yīng)，呈現(xiàn)量效和時效關(guān)系（p<0.05），其中20μg/ml洛鉑對MCF-7和MDA-MB-231作用72小時的抑制率分別為63.69％和76.00％。
　　 2 I

8、L-2對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖有抑制作用當(dāng)劑量范圍為3125～100000IU/ml時， IL-2對MCF-7和MDA-MB-231細胞的體外增殖抑制作用也呈現(xiàn)量效和時效關(guān)系（p<0.05），其中100000IU/ml IL-2作用72小時對MCF-7和MDA-MB-231的抑制率分別為34.03％和19.57％。
　　 3洛鉑和IL-2聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7和MDA－MB－231細胞增殖抑制率比單用洛鉑高聯(lián)合應(yīng)

9、用中相同劑量洛鉑和相同作用時間的實驗組細胞增殖抑制率較單獨應(yīng)用洛鉑時增強（p<0.05）。其中20.00μg/ml洛鉑與25000 IU/ml IL-2聯(lián)合作用72小時，MCF-7和MDA-MB-231細胞的抑制率分別為79.00％和82.29％，而單獨應(yīng)用洛鉑的細胞增殖抑制率分別為63.69％和76.00％。
　　 4 IL-2處理組MCF-7和MDA-MB-231細胞形態(tài)無明顯改變?nèi)鹗?姬姆薩染色染色結(jié)果顯示，25000IU

10、/ml IL-2處理24小時后，MCF-7和MDA-MB-231無明顯形態(tài)學(xué)改變。
　　 5洛鉑處理組和聯(lián)合處理組MCF-7和MDA-MB-231細胞形態(tài)呈現(xiàn)凋亡前期的形態(tài)學(xué)改變?nèi)鹗?姬姆薩染色染色結(jié)果顯示，1.25μg/ml洛鉑處理24小時后或1.25μg/ml洛鉑和25000IU/ml IL-2聯(lián)合作用后，MCF-7和MDA-MB-231細胞形態(tài)均呈現(xiàn)凋亡前期形態(tài)學(xué)改變。
　　 6洛鉑能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-

11、231細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對于MCF-7細胞，1.25μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml單獨洛鉑作用24小時，細胞凋亡率分別為18.40％、21.49％、31.57％。對于MDA-MB-231細胞，1.25μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml單獨洛鉑作用24小時，細胞凋亡率分別為6.15％、16.33％、20.39％。可見隨著洛鉑濃度的增高，兩種細胞凋亡率呈現(xiàn)升高趨勢。
　　 7 I

12、L-2不能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，25000IU/ml、50000IU/ml、100000IU/ml單獨IL-2作用24小時，MCF-7細胞凋亡率分別為3.79％、2.43％、3.31％，MDA-MB-231細胞凋亡率分別為7.55％、8.96％、9.64％。與對照組（MCF-7和MDA-MB-231細胞分別為2.91％和8.67％）比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 8洛鉑和I

13、L-2聯(lián)合應(yīng)用與單用洛鉑組比較，MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡率有所增加當(dāng)25000IU/ml IL-2分別與1.25μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml洛鉑聯(lián)合作用24小時后，MCF-7細胞凋亡率分別為27.01％、34.84％、40.86％，MDA-MB-231細胞凋亡率分別為6.83％、19.30％、25.48％，與相同濃度單用洛鉑組細胞凋亡率比較有所增加（p<0.05）。
　　 9洛鉑或IL-2

14、，以及兩種聯(lián)合作用對MCF-7和MDA-MB-231細胞syk、c-myc、p53 mRNA表達的影響不一半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，對于MCF-7細胞，在單獨應(yīng)用不同濃度洛鉑（5.00μg/ml、10.00μg/ml）和單獨應(yīng)用IL-2（25000IU/ml、50000IU/ml、100000IU/ml）時，各實驗組中細胞p53、c-myc、syk mRNA表達水平與對未處理組相比均有所降低（p<0.05）；而當(dāng)不同濃度洛鉑與25

15、000IU/ml IL-2聯(lián)合應(yīng)用時，各實驗組細胞p53、syk、c-myc mRNA的表達水平與未處理組相比則無顯著性差異（p>0.05）。
　　 對于MDA-MB-231細胞，在各不同處理組或?qū)φ战M中均未檢出syk mRNA的表達。在單獨應(yīng)用不同濃度洛鉑和單獨應(yīng)用不同濃度IL-2時，各實驗組細胞p53mRNA表達水平均高于對照組細胞，比較有顯著性差異（p<0.05），同時各實驗組細胞c-myc mRNA表達水平均低于對照組細

16、胞，比較有顯著性差異（p<0.05）。當(dāng)不同濃度洛鉑與25000IU/ml IL-2聯(lián)合應(yīng)用時，實驗組細胞中p53、c-myc mRNA表達變化不同，與未處理組相比有顯著性差異（p<0.05），而與相同濃度單獨應(yīng)用洛鉑實驗組比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1在體外洛鉑能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖，且具有明顯的量效和時效關(guān)系。并能誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　 2在體外IL-2對

17、MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖有抑制作用，具有量效和時效關(guān)系。但不能誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　 3洛鉑和IL-2聯(lián)合應(yīng)用，對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用高于單用洛鉑的作用。并仍能誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　 4對于MCF-7細胞，單獨應(yīng)用洛鉑或IL-2能下調(diào)細胞內(nèi)p53、syk、c-myc mRNA的表達。而當(dāng)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時三種不同基因表達水平無明顯下降。
　　 5對于MDA-MB-231細