禽傳染性支氣管炎病病毒分離株的鑒定及3CL基因片段的序列分析.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒感染引起了世界各國養(yǎng)禽生產(chǎn)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，該病的流行日趨嚴(yán)重，Ⅰ臨床疾病形式多樣化和血清型繁多，這為防制傳染性支氣管炎病毒不斷增加了難度。該病主要表現(xiàn)為引起肉雛雞的高發(fā)病率和高死亡率，常引起混合感染，導(dǎo)致增重減緩和飼料利用率的降低；引起蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋的品質(zhì)下降，所造成的生產(chǎn)效益下降通常比直接死亡引起的損失更大，因此對該病的病原性及其抗原性或血清型進(jìn)行必要的分析研究，顯得尤為的重要。本研究試圖通過病原學(xué)、血清學(xué)

2、實驗和3CL基因序列分析，分析我省從雞源的傳染性支氣管炎病毒株(GZ株)和孔雀分離得到的傳染性支氣管炎病毒株(PF株)的相關(guān)病原特性、致病性以及這兩個毒株與實驗室保存的其他三株雞源傳染性支氣管炎病毒株(Massachusetts標(biāo)準(zhǔn)毒株、YX毒株(嗜腎型)和PT毒株(呼吸型))之間的血清學(xué)或抗原型關(guān)系，填補我省對野禽傳染性支氣管炎病毒病原學(xué)方面的空白，為有效地預(yù)防和控制IBV引起的疾病提供一些參考資料，并為IBV地流行病學(xué)調(diào)查和分類學(xué)工

3、作提供素材。 本研究以五株不同的傳染性支氣管炎病毒株為研究材料，開展了病原學(xué)、血清學(xué)和基因序列測定的研究。 1．從臨床發(fā)病孔雀和雞中用常規(guī)的病毒分離方法采集病料，用SPF雞胚分離得到兩株較典型病變且含量較高的病毒株。 2．采用離子交換捕捉技術(shù)濃縮這兩株病毒株感染的雞胚的尿囊液，經(jīng)負(fù)染后觀察到直徑分別為110nm和125nm，有囊膜，呈圓形，表面有排列整齊的桿狀纖突似花冠狀病毒粒子。 3．血凝實驗：收集不同

4、的接毒時間的雞胚尿囊液(36h、48h、72h、96h和120h)，尿囊液經(jīng)過1％胰酶處理過后，得出未適應(yīng)雞胚的病毒株在接毒48h和72h后收取其尿囊液的血凝效價高；通過生理鹽水和PPS兩種緩沖液做對比，PBS可以使各個尿囊液表現(xiàn)比較穩(wěn)定的血凝效價。且各個尿囊液的血凝價隨著消化時間的延長而逐漸升高，第4h時的血凝價比較穩(wěn)定，同一個毒株的血凝效價隨著消化時間的延長逐步升高。 4．選擇1日齡的健康狀況良好的SPF雛雞按一定的免疫程序

5、，以點眼滴鼻的接種途徑人工感染雛雞。在雛雞免疫耐過后，采取其氣管、腎臟、腸、肝臟、肺等器官進(jìn)行病理學(xué)觀察。觀察結(jié)果表明：雛雞肝臟中央靜脈周圍浸潤大量炎性細(xì)胞，部分肝細(xì)胞顆粒變性和空泡變性。腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性和脂肪變性，腎小球浸潤大量的炎性細(xì)胞。腺胃腺體上復(fù)管狀有大量的炎性細(xì)胞浸潤。氣管黏膜廣泛水腫，黏膜上皮增厚，上皮細(xì)胞脫落。 5．采用氣管環(huán)組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行血清學(xué)中和實驗，取PF株、GZ株(本課題分離鑒定的分離株)與Y

6、X株、Mass標(biāo)準(zhǔn)毒株和PT毒株進(jìn)行中和實驗。試驗結(jié)果表明：GZ毒株與Yx毒株、PT毒株、PF毒株是屬于同一血清型的不同亞型，GZ毒株與Mass毒株是關(guān)系甚遠(yuǎn)的變異型或不同于Mass毒株的一個獨立的血清型。PF毒株與PT毒株、GZ毒株屬于同一血清型的不同亞型，與YX毒株、Mass毒株是屬于不同的血清型。實驗表明，五株病毒株都存在有一定的抗原相關(guān)性，且抗原相關(guān)有一定程度的不對稱。同時說明，PF分離株和GZ分離株屬于傳染性支氣管炎病毒。

7、 6．GZ分離株3CL基因的核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列分析與比較：GZ株的3CL基因片段在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，暫時與Beaudtte株處于同一個分支；3CL<'pro>基因的核苷酸序列和氨基酸序列與國內(nèi)分離的腎病變型毒株分屬于不同的系統(tǒng)進(jìn)化分支；3CL<'pro>基因的核苷酸序列和氨基酸序列與Beaudtte株的相關(guān)位點變化趨勢比較一致。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析來看，核苷酸序列或氨基酸序列同源性高的，其致病型并不一致。比如GZ株與Beaudtte株