IFN-誘導(dǎo)的p47 GTP酶在日本血吸蟲(chóng)急性感染中的作用研究.pdf

1、目前，血吸蟲(chóng)病防治面臨的棘手問(wèn)題之一在于再感染難以控制，人們一直期待采用人用疫苗作為化療重要的補(bǔ)充手段進(jìn)行疾病控制，因此，血吸蟲(chóng)感染宿主的免疫應(yīng)答規(guī)律作為疫苗研制的免疫學(xué)基礎(chǔ)受到更多關(guān)注。然而長(zhǎng)期以來(lái)，疫苗研制的理論基礎(chǔ)一直成為眾多學(xué)者有爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)意義上的以激發(fā)Th2型免疫應(yīng)答(以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子分泌為主，主要介導(dǎo)體液免疫)的血吸蟲(chóng)病疫苗，主要采用特異性抗體篩選優(yōu)勢(shì)抗原，所誘導(dǎo)的保護(hù)力往往并不理想

2、。目前更多的證據(jù)支持Th1型免疫應(yīng)答(以IFN-γ分泌為主，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫)作為抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制。 曼氏血吸蟲(chóng)感染小鼠模型中細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示，在童蟲(chóng)移行并發(fā)育成熟過(guò)程中，淋巴細(xì)胞主要產(chǎn)生針對(duì)童蟲(chóng)或成蟲(chóng)抗原的IFN-γ；隨著組織中蟲(chóng)卵的沉積(感染后5w)，細(xì)胞因子表達(dá)譜逐漸發(fā)生了改變，到感染后8w，主要以高水平的IL-4、IL-5為主，IFN-γ水平較低，提示在感染早期，IFN-γ,可能發(fā)揮重要的作用；在蟲(chóng)

3、卵沉積后，宿主的免疫應(yīng)答出現(xiàn)由Th1型向Th2型的漂移。本實(shí)驗(yàn)室前期采用基因芯片結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)研究日本血吸蟲(chóng)感染小鼠過(guò)程中觀察到：如同曼氏血吸蟲(chóng)感染，IFN-γ的基因轉(zhuǎn)錄水平從感染急性期至慢性期逐步受到抑制；但是值得關(guān)注的是，干擾素刺激基因(ISGs)(如：IGTP，GBP，ICSBP等)，受抑制程度尤為顯著，表現(xiàn)為下調(diào)發(fā)生較IFN-γ早(成蟲(chóng)排卵前)，且下調(diào)速度更快。ISGs是IFN-γ下游通路中的作用因子，其表達(dá)下調(diào)則反映出隨

4、著日本血吸蟲(chóng)感染進(jìn)程，宿主體內(nèi)存在著干擾素通路的抑制，阻礙干擾素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。 IFN-誘導(dǎo)的p47 GTP酶家族是近十年來(lái)在多種脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)重要的具有抗感染作用的蛋白家族。目前已經(jīng)克隆了小鼠p47GTP酶家族中的六個(gè)成員，分別是LRG-47、GTPI、IGTP、IRG-47、IIGP和TGTP/Mg21。研究發(fā)現(xiàn)，p47 GTP酶能夠特異地參與抵抗胞內(nèi)細(xì)菌和原蟲(chóng)的感染，對(duì)病毒的清除能力較弱。雖然同屬于p47 GTP

5、酶家族，但不同成員所表達(dá)的抗力具有病原體和時(shí)相特異性的特點(diǎn)。然而，p47 GTP酶在更為復(fù)雜的多細(xì)胞生物，例如重要的胞外蠕蟲(chóng)-血吸蟲(chóng)感染中的作用目前還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，p47GTP酶隨日本血吸蟲(chóng)感染進(jìn)程，信號(hào)強(qiáng)度呈下調(diào)趨勢(shì)，且家族中各成員的表達(dá)強(qiáng)度存在明顯差異，提示不同p47 GTP酶在多細(xì)胞生物感染中的作用可能不盡相同。在本研究中，我們探討了IFN-誘導(dǎo)的p47 GTP酶家族中的IGTP和IRG-47在日本血吸蟲(chóng)急性

6、感染中的作用特點(diǎn)及參與保護(hù)性免疫的能力，以進(jìn)一步深化血吸蟲(chóng)的感染免疫學(xué)，為血吸蟲(chóng)病疫苗研制提供理論基礎(chǔ)。 本研究采用IGTP基因敲除(IGTP-/-)和IRG-47基因敲除(IRG-47-/-)小鼠，以相同遺傳背景的野生型C57BL/6J小鼠(wild-type，WT)為對(duì)照，建立日本血吸蟲(chóng)急性感染的小鼠模型。為了觀察感染/致病結(jié)果，在感染后6w通過(guò)肝門(mén)靜脈沖蟲(chóng)計(jì)數(shù)成蟲(chóng)數(shù)、消化肝臟計(jì)數(shù)蟲(chóng)卵數(shù)，以HE染色和Masson三色染色觀察

7、肝臟的病理變化；為了觀察感染后宿主的整體免疫應(yīng)答反應(yīng)，以間接ELISA法檢測(cè)血清中日本血吸蟲(chóng)特異性IgG抗體，以Bio-plex技術(shù)檢測(cè)感染急性期血清和脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Thl/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平；鑒于p47 GTP酶主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞在天然免疫中的重要作用，我們觀察了基因敲除后對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響。通過(guò)貼壁法分離純化脾臟巨噬細(xì)胞后，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中p47 GTP酶家族三個(gè)成員(igtp、ι

8、rg47、irg47)的mRNA水平，以考察一種基因缺失后是否存在p47 GTP酶家族其他成員的交叉調(diào)控；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期(感染前、蟲(chóng)卵沉積前期、感染急性期)巨噬細(xì)胞上表面分子MHC-Ⅱ類(lèi)、CDl6/32、CD40、CD80的表達(dá)水平，觀察巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能；在脂多糖(LPS)刺激下，采用硝酸還原酶法觀察巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)的濃度；通過(guò)體外殺傷童蟲(chóng)的試驗(yàn)，觀察在血清抗體的協(xié)同下巨噬細(xì)胞的殺傷活性。 本研

9、究獲得如下主要結(jié)果： 1、在日本血吸蟲(chóng)急性感染過(guò)程中，IGTP4-/-小鼠與WT小鼠相比表現(xiàn)出相似的感染結(jié)局，而IRG-47-/-小鼠能部分限制急性感染。IGTP-/-組的成蟲(chóng)數(shù)和蟲(chóng)卵數(shù)略高于WT組，而與這兩組相比，感染后IRG-47-/-組小鼠的成蟲(chóng)數(shù)和蟲(chóng)卵數(shù)明顯減少。在HE染色的病理切片中，IGTP-/-組和WT組可見(jiàn)大量蟲(chóng)卵聚集在匯管區(qū)，而IRG-47-/-組集中在匯管區(qū)的蟲(chóng)卵則較少。在IRG-474-/-組，含有單個(gè)蟲(chóng)卵

10、的肉芽腫中可見(jiàn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞聚集，包繞蟲(chóng)卵的細(xì)胞總數(shù)也較IGTP-/-組和WT組顯著增多。Masson染色顯示，WT組蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)目偰z原含量顯著高于IGTP-/-組和IRG-47-/-組。 2、在日本血吸蟲(chóng)感染急性期，mG-47-/-小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平低于IGTP-/-小鼠和WT小鼠，IGTP-/-、鼠較WT小鼠有所增強(qiáng)。血清中細(xì)胞因子檢測(cè)顯示，IGTP4-/-小鼠和WT小鼠在感染急性期能夠產(chǎn)生大量的Th1/Th2型

11、細(xì)胞因子，且IGTP-/-小鼠較WT小鼠產(chǎn)生較多的GM-CSF和IL-2。但是，IRG-47-/-小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞因子，無(wú)論是Th1型還是Th2型，都顯著低于IGTP-/-小鼠和WT小鼠。脾淋巴細(xì)胞以可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)或ConA刺激后檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子顯示，在特異性抗原和有絲分裂原刺激下，IGTP-/-小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12P70、TNF-α、IFN-γ/、GM-CSF、IL-5和IL-10的水平均較WT小鼠顯著增高。I

12、RG-47-/-組與WT組相比，在ConA刺激下，IRG-47-/-組脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p70和I-10水平高于WT組，余細(xì)胞因子在兩組間無(wú)顯著性差異。 3、就產(chǎn)生成蟲(chóng)特異性IgG抗體的能力而言，IGTP-/-小鼠略強(qiáng)于IRG-47-/-小鼠和WT小鼠。隨著日本血吸蟲(chóng)感染的發(fā)展，三組小鼠血清中日本血吸蟲(chóng)特異性IgG抗體水平均持續(xù)升高。在日本血吸蟲(chóng)急性感染期，針對(duì)可溶性成蟲(chóng)抗原(SWAP)特異的IgG抗體水平，在IGTP-/

13、-組小鼠顯著高于IRG-47-/-組和WT組；針對(duì)可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)特異的IgG抗體水平，在三組小鼠間均無(wú)顯著性差異。 4、 irg47基因缺失后可能存在igtp和ιrg47基因的交叉調(diào)控。從感染后3w到6w，在WT小鼠的巨噬細(xì)胞中，igtp和ιrg47基因的表達(dá)有下降趨勢(shì)，而irg47基因變化較小。在IGTP-/-小鼠的巨噬細(xì)胞中，ιrg47和irg47基因表達(dá)下調(diào)。相反，在IRG-47-/-小鼠的巨噬細(xì)胞中，igtp基

14、因的表達(dá)變化較少，而ιrg47基因的表達(dá)明顯上調(diào)。這提示IRG-47缺失后可能存在igtp和ιrg47基因的交叉調(diào)控，而IGTP缺失則不存在。 5、 igtp或irg47基因缺失不影響巨噬細(xì)胞發(fā)育成熟。隨著日本血吸蟲(chóng)感染的發(fā)展，巨噬細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ類(lèi)(I-A)、CD16/32、CD40和CD80，無(wú)論是在基因敲除小鼠還是野生型小鼠的表達(dá)均明顯上升。在感染前和感染后3w，IGTP-/-組CDl6/32和CD40的表達(dá)均較IR

15、G-47-/-組和WT組高；在感染后6w，三組間各分子標(biāo)記的表達(dá)均無(wú)顯著性差異。巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)類(lèi)型提示，在日本血吸蟲(chóng)感染早期，igtp基因缺失時(shí)，可能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞CD16/32(FcγⅢ/Ⅱ)介導(dǎo)的抗原遞呈處理能力。 6、在日本血吸蟲(chóng)感染急性期，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子NO的潛能不受IGTP和IRG-47缺失的影響。在日本血吸蟲(chóng)感染前，不論有無(wú)LPS刺激，各組巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO均無(wú)顯著差異。在感染后6w，無(wú)任何刺激的情況下，

16、IGTP-/-組的巨噬細(xì)胞較IRG-47-/-組和WT組的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的NO；而以LPS刺激后三組巨噬細(xì)胞產(chǎn)生N0水平無(wú)顯著性差異。 7、感染活化的巨噬細(xì)胞與血清體外協(xié)同殺傷童蟲(chóng)試驗(yàn)顯示，IGTP-/-組的童蟲(chóng)死亡率顯著高于WT組。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，感染活化的巨噬細(xì)胞協(xié)同日本血吸蟲(chóng)感染血清或青蒿琥酯化療血清具有殺傷童蟲(chóng)活性。以日本血吸蟲(chóng)感染IGTP-/-、IRG-47-/-和WT小鼠6w的巨噬細(xì)胞和相應(yīng)的血清體外協(xié)同殺傷童

17、蟲(chóng)試驗(yàn)顯示，IGTP-/-組的童蟲(chóng)死亡率為37.5％，明顯較WT組(29.41％)高。IGTP-/-組的高童蟲(chóng)死亡率可能與其血清中針對(duì)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)特異性IgG抗體水平較高有關(guān)。 綜上，在日本血吸蟲(chóng)急性感染期，IGTP-/-小鼠和IRG-47-/-小鼠在感染/致病結(jié)局、整體免疫應(yīng)答，以及巨噬細(xì)胞功能等方面均存在明顯的差異，提示不同p47 GTP酶(IGTP，IRG-47)在宿主建立對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染抗力過(guò)程中可能發(fā)揮著不同的作用。