日本血吸蟲入侵宿主過程中關鍵尾蚴蛋白酶的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種由血吸蟲侵染人類及其它哺乳動物引起的人畜共患寄生蟲病，在我國流行的是日本血吸蟲病。目前還沒有預防血吸蟲病的有效方法，而唯一的有效治療藥物吡喹酮已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性，因此亟待開發(fā)預防和控制血吸蟲病的新方法。
　　目的：血吸蟲以尾蚴的形式入侵終宿主，進而對宿主造成嚴重危害。在侵染過程中，尾蚴分泌的蛋白酶發(fā)揮了主要作用，研究血吸蟲入侵宿主相關的尾蚴蛋白酶有助于揭示血吸蟲侵染宿主分子機制和預防血吸蟲病。本文對日本血吸蟲入侵宿主相關

2、的尾蚴蛋白酶進行了深入研究。
　　方法：首先對日本血吸蟲尾蚴可溶性總蛋白和尾蚴分泌蛋白分別進行質(zhì)譜分析，篩選其中可能與血吸蟲入侵宿主有關的尾蚴蛋白酶;然后對組織蛋白酶B2（SjCB2）、尾蚴彈性蛋白酶(SjCE2b)、鈣蛋白酶(Sjcalpain)、金屬內(nèi)肽酶（SjME）、M17家族氨基肽酶(SjM17)、線粒體金屬肽酶M16(SjM16)和蛋白酶體β型7亞單位（SjP7）七種日本血吸蟲尾蚴蛋白酶基因進行了原核克隆表達及純化;將純

3、化的重組蛋白分別免疫新西蘭白兔制備兔多克隆抗體并用ELISA檢測多克隆抗體的效價;利用免疫熒光定位技術觀察SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴組織中的分布情況;通過麥胚無細胞表達體系表達可溶性的重組SjCB2和SjCE2b蛋白，分別測定無細胞表達產(chǎn)物、尾蚴可溶性抽提總蛋白和尾蚴分泌蛋白中SjCB2和SjCE2b的酶活性;我們還利用蛋白酶特異性抑制劑在小鼠體內(nèi)分析了SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain在日本血吸蟲入侵

4、過程中的作用。
　　結果：質(zhì)譜分析結果表明，尾蚴可溶性抽提總蛋白鑒定出685種蛋白，而尾蚴分泌蛋白鑒定出59種;成功實現(xiàn)了SjCB2， SjCE2b， Sjcalpain催化活性位點片段和Ca2+結合位點片段，SjME，SjM17，SjM16和SjP7的原核表達，相對分子質(zhì)量(Mr)分別約為65 KDa、31 KDa、43 KDa和39 KDa、50 KDa、60 KDa、51 KDa和34 KDa，均與預期大小一致，組氨酸標簽親

5、和層析成功純化得到8種目的重組蛋白;間接ELISA結果顯示純化蛋白對應的多克隆抗體效價均超過1∶80000;免疫定位結果顯示，SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain均主要分布在日本血吸蟲尾蚴頭部;酶活測定結果顯示，無細胞表達產(chǎn)物、尾蚴總蛋白和尾蚴分泌蛋白中均顯示出較高的SjCB2和SjCE2b蛋白酶活性;尾蚴侵染抑制實驗中，尾蚴與SjCB2特異性抑制劑，SjCE2b特異性抑制劑，Sjcalpain特異性抑制劑和SjCE2b兔多抗孵

6、育后感染小鼠，減蟲率分別為48.0％、33.3％、17.4％和27.2％。
　　結論：SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴中均有較高的豐度且主要分布于尾蚴頭部，體內(nèi)抑制劑實驗結果表明SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain三種蛋白酶均參與了日本血吸蟲尾蚴入侵宿主皮膚的過程。
　　綜上所述，本研究利用蛋白酶學、分子生物學以及免疫學等方法對日本血吸蟲入侵宿主相關尾蚴蛋白酶的功能進行了深入研究，研究結果為日本血吸