HIV-1新發(fā)急性感染者pDC數(shù)量、活化及IFN-α分泌功能的研究.pdf

1、目的：
　　 獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的一種嚴重傳染病。HIV主要侵犯免疫系統(tǒng)的CD4+T淋巴細胞,造成機體免疫功能下降,最終因患各種機會性感染或腫瘤而死亡。HIV新發(fā)急性感染是指HIV病毒進入人體的最初6個月,是宿主免疫系統(tǒng)與病毒之間相互斗爭的關(guān)鍵階段,

2、在免疫系統(tǒng)發(fā)揮殺傷作用后病毒從高水平下降到一個穩(wěn)定水平,即病毒調(diào)定點,研究顯示病毒載量調(diào)定點越高,進入AIDS期越快,病人存活時間越短,病毒與機體免疫相互作用影響和決定著HIV感染者的疾病結(jié)局。研究HIV新發(fā)急性感染者細胞免疫應(yīng)答的變化對于明確HIV感染的免疫致病機制、判斷疾病進展及預(yù)后有著重要的作用。天然免疫是人體對抗HIV感染的第一道防線。CD123+類漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells,p

3、DC)作為天然免疫中的重要效應(yīng)細胞可能在HIV新發(fā)急性感染中起著重要作用。
　　 pDC是樹突狀細胞(dendritic cells,DC)的一個重要亞群,連接天然免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng),在病毒刺激下能夠產(chǎn)生大量的IFN-α,發(fā)揮直接的抗病毒活性[8],并且能通過激活NK、NKT等天然免疫細胞發(fā)揮天然免疫反應(yīng)。此外,pDC在一定程度上能提呈抗原給T細胞,刺激T細胞活化,發(fā)揮適應(yīng)性免疫反應(yīng)。有體外研究顯示,HIV感染后,pDC產(chǎn)

4、生大量的IFN-α,并且上調(diào)共刺激分子CD80/CD86和成熟標(biāo)志CD83的表達,并且pDC主要通過Foll樣受體(toll-likereceptor,TLR)7和9對HIV RNA進行識別。TLR7和TLR9表達于pDC的酸性內(nèi)含體(endosome),TLR7主要識別病毒ssRNA,TLR9主要識別病毒CpG-ODN片段進行信號傳導(dǎo),最終通過激活NF-κB,影響pDC功能的發(fā)揮。pDC的功能主要是產(chǎn)生大量的IFN-α,因此研究IFN

5、-α的變化情況對于pDC功能的判定起著重要作用。
　　 HIV感染能引起外周血pDC數(shù)量和功能的變化。目前對HIV慢性感染者研究較多,國外和本實驗室的前期研究結(jié)果均顯示,HIV慢性感染者pDC數(shù)量減少,并與疾病進展階段有關(guān),共刺激分子CD80/CD86和成熟標(biāo)志CD83表達上調(diào),但是對于IFN-α分泌的研究結(jié)果卻存在爭議,有研究報道HIV感染者IFN-α的產(chǎn)生增加并且與病毒載量和疾病進展無關(guān),也有研究報道IFN-α的產(chǎn)生減少并與

6、機會性感染和疾病進展有關(guān)。而國際上對HIV新發(fā)急性感染者的研究較少,且多集中于數(shù)量的研究,大量研究結(jié)果顯示,HIV新發(fā)急性感染者pDC數(shù)量明顯下降,并且研究顯示pDC數(shù)量與病毒載量呈顯著負相關(guān),但是pDC數(shù)量與病毒調(diào)定點的關(guān)系尚未見報導(dǎo)。此外HIV新發(fā)急性感染者pDC共刺激分子CD80/CD86和成熟標(biāo)志CD83的表達國內(nèi)外尚未見報道。關(guān)于HIV新發(fā)急性感染者pDC產(chǎn)生IFN-α的情況國內(nèi)外鮮見報導(dǎo),尤其是尤其是HIV感染者TLR7和T

7、LR9表達,信號傳導(dǎo)通路及其與IFN-α分泌之間的關(guān)系國內(nèi)外尚未見報導(dǎo)。
　　 中國人群的遺傳特征和HIV流行毒株也與歐美人群不同,因此對中國人群pDC數(shù)量和功能進行研究非常重要。而且HIV新發(fā)急性感染病例很難得到,國內(nèi)外對HIV新發(fā)急性感染者pDC的變化情況鮮見報道。本課題擬對HIV新發(fā)急性感染者pDC的數(shù)量、活化和成熟狀態(tài)、細胞因子IFN-α分泌進行系統(tǒng)研究,對TLR7、9表達及其信號傳導(dǎo)通路活化進行研究,明確HIV新發(fā)急性

8、感染者pDC數(shù)量與功能的變化及其。TLR7、9信號傳導(dǎo)機制,明確pDC數(shù)量和功能與病毒調(diào)定點之間的關(guān)系,揭示pDC在HIV疾病進展中的作用,為HIV的免疫治療提供新的思路。
　　 方法：
　　 1、研究對象
　　 HIV感染的男男性接觸者83例,按感染時間不同分為HIV新發(fā)急性感染者(primary HIV infection,PHI)和HIV慢性感染者(chronic HIV infection,CHI)。HI

9、V新發(fā)急性感染者37例,年齡平均32(23-45)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)(滿足下列一項或多項者即可納入):①在6個月內(nèi)HIV抗體開始變陽性;②HIV抗體陰性但HIV RNA陽性;③HIV抗體弱陽性但在2周內(nèi)可以重復(fù)并OD值較前次升高;④有早期HIV感染的臨床癥狀、HIV抗原陽性及WB抗體檢測少于4條蛋白帶。HIV慢性感染者46例,平均年齡37(25-59)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):未接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療,感染時間一年以上。健康對照組15例,平均年齡30(24

10、-45)歲,入選標(biāo)準(zhǔn):血常規(guī)及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性,無免疫系統(tǒng)疾病。
　　 2、CD4+T細胞絕對值的檢測
　　 將20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中,逆向加樣法加入50μl混勻的抗凝全血,室溫避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室溫避光15min,應(yīng)用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測,MultiSET軟件分析結(jié)果,得到C

11、D4+T淋巴細胞的絕對值。
　　 3、pDC細胞絕對計數(shù)
　　 將15ul lineagel-FITC、6ulCD123-PE、6ulHLA-DR-PerCp依次加入絕對計數(shù)管中,再加入100ul抗凝全血,室溫避光15分鐘,加入BD公司免沈溶血素450ul,室溫避光15分鐘,用流式細胞儀CELLQUEST軟件檢測并進行分析,獲得pDC細胞絕對值。
　　 4、pDC表面標(biāo)志CD86、CD83的檢測
　　 復(fù)

12、蘇2×106 PBMC(外周血單個核細胞),并平均分配至2個流式細胞管中。做好標(biāo)記,并分別加入相應(yīng)的熒光抗體組合,混勻,4℃冰箱避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后,每管加入3ml鞘液重懸,離心,棄上清。混勻后加入含1％多聚甲醛的固定液200μl重懸,應(yīng)用FACSAria流式細胞儀進行檢測,BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 5、pDC IFN-α的分泌及相關(guān)傳導(dǎo)通路的檢測
　　 取一塊12孔板,將將復(fù)蘇好的6×10

13、6 PBMC分別放入兩個孔中,其中一孔加終濃度為5μg/ml的R848,另一孔加終濃度為5μg/ml的CpGODN2216,充分混勻后,將12孔板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12小時后兩孔中分別加入Golgi Plug,輥勻,繼續(xù)培養(yǎng)10小時。孵育結(jié)束后取6支流式管,各管中均加入單克隆熒光抗體組合Lin-PerCP/CY5.5/HLA-DR-APC-CY7/CD123-PE-CY7,將細胞加入到相應(yīng)各管中,混勻,4℃冰箱避光孵育

14、30分鐘。表面染色后,加入Cytofix/Cytoperm solution4℃冰箱中破膜20分鐘。破膜結(jié)束后,洗滌,各管加入胞內(nèi)染料組合后充分混勻,4℃冰箱避光孵育30分鐘。洗滌,多聚甲醛固定后應(yīng)用LSRⅡ流式細胞儀進行檢測,BD FACSDivTM軟件分析結(jié)果。
　　 6、HIV病毒載量測定
　　 以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor1.5試劑盒在COBAS AM

15、PLICOR自動載量儀上以RT-PCR方法測定病毒載量。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示,兩組間實驗指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U檢驗,相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、pDC數(shù)量的變化研究:
　　 1、HIV新發(fā)急性感染者外周血pDC絕對值與慢性感染者及健康對照的比

16、較:
　　 HIV新發(fā)急性感染者pDC平均值為7.46±2.86個/μl,顯著低于健康對照組(11.22±4.22個/μl,P＜0.001),但與HIV慢性感染者(8.06±3.18個/μl)相比無顯著性差異。
　　 2、HIV感染者pDC數(shù)量與病毒載量及CD4+T細胞數(shù)量的關(guān)系:
　　 HIV新發(fā)急性感染者pDC絕對值與病毒載量水平顯著負相關(guān)(r=-0.418,p=0.034),與CD4+T淋巴細胞數(shù)量無相關(guān)性

17、(r=0.369,p=0.07)。HIV慢性感染者pDC絕對值與病毒載量顯著負相關(guān)(r=0.501,p=0.019),與CD4+T淋巴細胞數(shù)量顯著正相關(guān)(r=0.462,p=0.009)
　　 3、pDC絕對值與病毒調(diào)定點的關(guān)系:
　　 根據(jù)病毒調(diào)定點的高低將26例HIV新發(fā)急性感染者分為兩組,其中14例病毒調(diào)定點＞104copies/ml為高病毒調(diào)定點組,12例病毒調(diào)定點＜104copies/ml為低病毒調(diào)定點組。高病

18、毒調(diào)定點組的14例HIV新發(fā)急性感染者pDC平均值為5.76(2.36-11.46)個/μl,顯著低于低病毒調(diào)定點組的12例HIV新發(fā)急性感染者9.30(4.79-13.13)個/μl(P＜0.05)。
　　 二、pDC表面標(biāo)志的變化研究:
　　 1、HIV新發(fā)急性感染者pDC表面表達標(biāo)志與健康對照和慢性感染者的比較:
　　 HIV新發(fā)急性感染者和HIV慢性感染者pDC表達CD83和CD86的百分比顯著高于健康對

19、照組(P=0.001,P=0.032)。
　　 2、HIV感染者pDC表面標(biāo)志與病毒載量及CD4+T細胞的關(guān)系:
　　 HIV新發(fā)急性感染者pDC表面CD86的表達與病毒載量顯著正相關(guān)(P=0.024),與CD4+T細胞沒有顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.199)(圖8)。HIV慢性感染者pDC表面CD86的表達與病毒載量顯著正相關(guān),與CD4+T細胞顯著負相關(guān)(P=0.019,P=0.026)
　　 三、pDC功能的變化研

20、究:
　　 1、在TLR7、TLR9的激動劑R848、CpG-ODN的刺激作用下pDC產(chǎn)生IFN-α能力的變化情況:
　　 在TLR7激動劑R848刺激作用下,HIV新發(fā)急性感染組pDC產(chǎn)生的IFN-α高于健康對照組和慢性感染組(P=0.01,P=0.002)。在TLR9激動劑CpG-ODN的刺激作用下,HIV新發(fā)急性感染者pDC產(chǎn)生的IFN-α顯著高于慢性感染組(P=0.018),而與健康對照組相比沒有顯著性差異(P=

21、0.348)
　　 2、IFN-α的產(chǎn)生與CD4+T細胞和病毒載量的相關(guān)關(guān)系:
　　 在TLR9激動劑CpG-ODN的刺激作用下,HIV新發(fā)急性感染者pDC產(chǎn)生的IFN-α與病毒載量顯著負相關(guān)(r=0.736,p=0.01)
　　 3、IFN-α的產(chǎn)生與病毒調(diào)定點的關(guān)系:
　　 根據(jù)病毒調(diào)定點的高低將11例HIV新發(fā)急性感染者分為兩組,其中5例病毒調(diào)定點＞105copies/ml為高病毒調(diào)定點組,5例病毒

22、調(diào)定點＜103copies/ml為低病毒調(diào)定點組。在CpG-ODN刺激作用下高病毒調(diào)定點組的5例HIV新發(fā)急性感染者pDC所產(chǎn)生的IFN-α MFI顯著低于低病毒調(diào)定點組的(P=0.047)
　　 4、TLR7和TLR9的表達及TLR7傳導(dǎo)通路中NF-κ B的變化情況:
　　 TLR7在HIV新發(fā)急性感染組中的表達顯著高于健康對照組(P=0.049),而與HIV慢性感染者相比沒有顯著性差異。TLR9在HIV新發(fā)急性感染組

23、中的表達顯著高于慢性感染組(P=0.037),而與健康對照組相比沒有顯著性差異(P=0.282)。NF-κ B在HIV新發(fā)急性感染者pDC中的表達顯著高于健康對照組(P=0.024),而與慢性感染者相比沒有顯著性差異(P=0.287)。
　　 結(jié)論：
　　 1、HIV新發(fā)急性感染者外周血pDC絕對值顯著降低,pDC的成熟標(biāo)志CD83和活化標(biāo)志CD86的表達顯著增高,提示HIV感染早期pDC數(shù)量減少,且處于高活化狀態(tài),產(chǎn)生

24、的IFN-α增高。提示HIV感染早期pDC數(shù)量下降,但功能增強。
　　 2、首次研究HIV新發(fā)急性感染者pDC內(nèi)TLR7和TLR9傳導(dǎo)通路的變化,發(fā)現(xiàn)HIV新發(fā)急性感染者pDC的TLR7-NF-κ B-IFN-α傳導(dǎo)通路中TLR7和NF-κ B表達以及IFN-α分泌水平顯著高于健康對照,TLR7表達與IFN-α分泌水平顯著正相關(guān);TLR9-NF-κ B-IFN-α傳導(dǎo)通路中TLR9表達和IFN-α分泌水平顯著高于HIV慢性感染者