誘生內(nèi)源性IFN-γ的日本血吸蟲抗原表位PDDV的構(gòu)建與篩選.pdf

1、血吸蟲病是一種世界范圍內(nèi)分布的主要公共衛(wèi)生疾病，全世界約2億多人受感染。在所有能夠引起肝纖維化的疾病中，血吸蟲病是其中的主要病因。而肝纖維化及門脈高壓是日本血吸蟲病人死亡的主要原因。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人群調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重肝纖維化的形成與較強(qiáng)的Th2類免疫反應(yīng)及較弱的Th1反應(yīng)明顯相關(guān)。研究證明CD4<'+>Th2細(xì)胞是影響血吸蟲病肝臟免疫病理的主要因素，其中IL-13和IL-4是導(dǎo)致肝臟纖維化的主要細(xì)胞因子，IL-10、IL-12、

2、IFN-γ在阻止慢性血吸蟲病形成嚴(yán)重肝纖維化中起重要作用，其中Th1類細(xì)胞因子IFN-γ對(duì)肝纖維化的抑制作用已經(jīng)獲得臨床研究的證實(shí)。為了探討日本血吸蟲抗原所誘導(dǎo)的Th1類免疫應(yīng)答對(duì)日本血吸蟲感染引起的肝纖維化的下調(diào)作用，為預(yù)防和治療血吸蟲病肝纖維化開辟一條新路，也對(duì)其它疾病所致的肝纖維化的免疫治療提供一定的參考資料，本研究將以往研究獲得的4個(gè)日本血吸蟲抗原T細(xì)胞表位構(gòu)建成PDDV(peptide-DNA dual vaccine)疫苗，

3、并且從中篩選能誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)Th<,1>類免疫應(yīng)答的一種或幾種PDDV，以期進(jìn)一步用于血吸蟲感染急性期及慢性期小鼠模型，觀察其對(duì)肝纖維化的下調(diào)作用。研究包括以下主要內(nèi)容及結(jié)果： 研究?jī)?nèi)容一：本研究室以往研究獲得4個(gè)日本血吸蟲T細(xì)胞表位P4、P6、P18和P22。首先我們?cè)O(shè)計(jì)并合成4個(gè)表位肽的編碼DNA，利用低熔點(diǎn)膠存在條件下的基因重組方法，將4種表位編碼基因分別與CpG ODN(1826)或IL-12基因(作為核酸疫苗佐劑)重組進(jìn)入p

4、CI-neo質(zhì)粒載體，通過(guò)酶切、PCR初步鑒定獲得陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)證明重組克隆與設(shè)計(jì)的序列完全一致。將合成的帶有18個(gè)賴氨酸(K18)的陽(yáng)離子表位肽與帶有陰離子電荷的重組質(zhì)粒載體的HBS溶液按照一定的電荷比值進(jìn)行配比，制備成一定鹽濃度的多肽-DNA復(fù)合物溶液-PDDV(peptide-DNA dual vaccine)溶液。為了獲得高質(zhì)量的PDDV，即陽(yáng)離子肽能有效包裹DNA免于被核酸酶所降解，并且使PDDV大小為20nm左

5、右，形態(tài)均一的顆粒，我們進(jìn)行了沉淀試驗(yàn)、阻滯試驗(yàn)、DNase Ⅰ消化試驗(yàn)及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在鹽濃度為150mM，陽(yáng)離子與陰離子電荷比值(r)為4時(shí)制備的PDDV為符合以上條件的高質(zhì)量的PDDV。 研究?jī)?nèi)容二：將4種表位肽與含有表位肽編碼基因及IL-12基因的重組質(zhì)粒按照研究一中獲得的條件制備4種PDDV：[K]<,18>P<,4>-pCI-P<,4>-IL-12、[K]<,18> P<,6>-pCI-P<,6>-IL-12、[K]

6、<,18>P<,18>-pCI-P<,18>-IL-12、[K]<,18>P<,22>-pCI-P<,22>-IL-12及4種PDDV的等量混合物。將四種表位肽與含有相應(yīng)的表位肽基因及CpGODN1826的重組質(zhì)粒制備另外4種PDDV：[K]<,18>P<,4>-pCI-P<,4>-CPG1826、[K]<,18>P<,6>-pCI-P<,6>-CPG1826 、 [K]<,18>P<,18>-pCI-P<,18>-CPG1826 、

7、[K]<,18>P<,22>-pCI-P<,22>-CPG1826及4種PDDV的等量混合物。另外，使用不含表位肽基因而只含有CpG ODN或者IL-12的質(zhì)粒與K18制備的PDDV([K]<,18>-pCI-neo-CpG1826、 [K]<,18>-pCI-neo-IL-12 <,12>)作為陰性對(duì)照。使用溶劑HBS作為以上所有組的空白對(duì)照免疫小鼠C57BL/6(共分13組，見后)。3次免疫后剖殺小鼠，分離、培養(yǎng)脾臟及淋巴結(jié)細(xì)胞，通

8、過(guò)增殖試驗(yàn)觀察再次使用抗原肽刺激后淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)水平；取細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)IFN-γ及IL-4水平。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：動(dòng)物免疫分組情況 1、[K]18P4-PCI-P4-IL-12 7、[K]18P4-PCI-P4-CpG18262、[K]18P6-PCI-P6-IL-12 8、[K]18P6-PCI-P6-CPG18263、[K]18P18-PCI-P18-IL-12 9、[K]18P18-PCI-P18-CPG18264

9、、[K]18P22-PCI-P22-IL-12 10、[K]18P22-PCI-P22-CpG18265、以上4種PDDV的等 11、以上4種PDDV的等量混合物量混合物 12、[K]18-PCI-neo-CpG18266、[K]18-PCI-neo-IL-12 13、HBS1、第8組([K]<,18>P<,6>-pCI-P<,6>-CpG1826 PDDV免疫組)使用SWAP及表位肽[K]<,18>P<,6>刺激后淋巴細(xì)胞增殖水平都明

10、顯高于陰性對(duì)照組，并且IFN-γ水平較陰性對(duì)照組明顯升高(P<0.01，而[K]<,18>P<,6>刺激IL-4水平較陰性對(duì)照組低，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明[K]<,18>P<,6>-pCI-P<,6>-CPG1826PDDV能夠較強(qiáng)誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答，P6很可能是優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答的表位。 2、使用4種表位分別與IL-12基因重組質(zhì)粒制備的PDDV混合物免疫小鼠后(第5組)，淋巴細(xì)胞增殖高于4種PDDV分別免疫組(第1

11、、2、3、4組)的表位肽刺激的淋巴細(xì)胞增殖水平。用4種表位及含有CpG ODN重組質(zhì)粒制備的PDDV混合物免疫組(第11組)的淋巴細(xì)胞增殖水平也明顯高于四種PDDV分別免疫組。此外，第5組IFN-γ水平及IL-4升高也很明顯，以IL-4升高更為顯著，因此我們認(rèn)為幾個(gè)表位的混合PDDV的作用要較單個(gè)表位的PDDV的作用相對(duì)較強(qiáng)。而用4種表位分別與含有CpG ODN的重組質(zhì)粒制備的PDDV混合物免疫小鼠后(第11組)，淋巴細(xì)胞明顯增殖的同時(shí)

12、，IFN-γ的產(chǎn)生明顯下降，而IL-4水平則有所升高，提示4種表位PDDV混合后可能既能誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)Th2類免疫應(yīng)答。 因此在這4種表位中有可能既有Th1類表位，又有Th2類表位，但此結(jié)論為一次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，尚需再次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 綜上，本研究用基因重組技術(shù)獲得分別含有P4、P6、P18、P22 4種表位基因及CpG ODN的4種重組質(zhì)粒，及此4種表位與IL-12基因的重組質(zhì)粒。通過(guò)沉淀試驗(yàn)、阻滯試驗(yàn)、Dn