光動力學(xué)療法凈化異基因活化T細(xì)胞預(yù)防aGVHD的實驗研究.pdf

1、　　目的：
　　建立Rhodamine123(Rh123)介導(dǎo)的光動力學(xué)療法,觀察光動力學(xué)療法對小鼠及人淋巴細(xì)胞增殖、活化功能的影響；對小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞集落形成的影響；探討光動力學(xué)療法在選擇性滅活對宿主抗原特異反應(yīng)的人活化T淋巴細(xì)胞時,保留靜息T細(xì)胞對新的第三抗原的反應(yīng)活性的特性；觀察光動力學(xué)療法在小鼠異基因骨髓移植中預(yù)防急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用,探討光動力學(xué)療法調(diào)控預(yù)防aGVHD的可行性及安全性。
　　方

2、法：
　　1 光動力學(xué)療法實驗條件的建立：選擇氬離子激光器(波長514 nm)。取BALB/c小鼠脾單個核細(xì)胞(MNC),經(jīng)絲裂霉素滅活作為刺激細(xì)胞,C57BL/6小鼠脾MNC作為反應(yīng)細(xì)胞, 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72 h,做如下四種處理：(1)加入Rh123(50 nmol/L),分組孵育不同時間,流式細(xì)胞儀檢測不同時間點細(xì)胞對Rh123熒光攝取率及平均熒光強度；(2)混合淋巴細(xì)胞加入不同濃度Rh123(終濃

3、度分別為10 nmol/L-60 nmol/L),MTT法測A570；(3)混合淋巴細(xì)胞接受不同劑量的激光照射(功率密度10 mW/cm2-60 mW/cm2,分組照射3 min或4 min),MTT法測A570；(4)混合淋巴細(xì)胞先加Rh123(50 nmol/L),再接受激光照射(功率密度10 mW/cm2-60 mW/cm2,照射3 min或4 min),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,MTT法測A570。博士學(xué)位論文：光動力學(xué)療法凈化異基因活

4、化T細(xì)胞預(yù)防aGVHD的實驗研究摘要2光動力學(xué)療法對小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞集落形成的影響：取c57BL/6小鼠骨髓MNC,加燦123(30 runol/L、40 nrnol/L、50 nrnol/L、60 nmol幾)孵育,接受激光照射(功率密度分別為10 mw/cmZ、20 mw/emZ、30 mw/emZ、50mw/c mZ),37℃、5%c02培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d。多功能倒置顯微鏡下觀察,計數(shù)粒巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU一GM)集落。

5、3光動力學(xué)療法對小鼠T淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)CD69+表達的影響：小鼠混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)24h,加燦1 23(50 nmol幾)、激光30 mwzemZ照射3 min。流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD69+陽性表達率。4光動力學(xué)療法對宿主抗原特異反應(yīng)人淋巴細(xì)胞的選擇性滅活：取健康人A、B、C來源的三份外周血MNC,A、C作為刺激細(xì)胞預(yù)先經(jīng)絲裂霉素滅活,B作為反應(yīng)細(xì)胞；按刺激細(xì)胞刀反應(yīng)細(xì)胞B(S瓜)比例1：1混合,于%孔板,37oC、5%COZ培養(yǎng)

6、箱培養(yǎng)72h；取出細(xì)胞,加Rhl23孵育(50nmol/L) 40min,分別接受激光不同功率密度(10 mwzemZ、30 mw/emZ、50 mw/e時)照射3 min；將經(jīng)以上光動力學(xué)處理的混合細(xì)胞再做如下2種處理：(l)再加入刺激細(xì)胞A： 2)再加入刺激細(xì)胞C,繼續(xù)培養(yǎng)24h；MTI,法測A570。5小鼠異基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGvHD)模型建立：以BALB/cH一Zd為受鼠,C57B/6H一b為供鼠。預(yù)處理方案為

7、全身照射(TBI),“oCo,8, 0 oy,劑量率：0.7513。oy/min。BALB/。“一Zd受鼠照射后6h經(jīng)尾靜脈注射C57B/6H一Zb供鼠骨髓(總數(shù)4x一06)+e57a/6H‘Zb供鼠脾臟淋巴細(xì)胞(總數(shù)4 x 106)。設(shè)注射生理鹽水組、同基因骨髓移植組、異基因骨髓移植組為對照。6光動力學(xué)療法預(yù)防aGVHD的小鼠移植實驗：將c57B/6H一2b供鼠骨髓(4丫106)與經(jīng)過光動力學(xué)處理的混合淋巴細(xì)胞(總數(shù)4.0x106)混

8、合,移植給BALB/cH一2d受鼠。觀察移植后小鼠aGvHD發(fā)生及存活情況。取小鼠的肝、脾、肺、皮膚、腸、骨髓組織,制片,HE染色,觀察病理。結(jié)果1建立光動力學(xué)療法實驗條件：(1)以氫離子激光器(波長514tun)為光源,肋123為光敏劑；(2)燦123孵育濃度為50nmol/L；(3)助123孵育時間為40min,博士學(xué)位論文：光動力學(xué)療法凈化異墓因活化T細(xì)胞預(yù)防aGvHD的實驗研究摘要 4)激光照射功率密度為30 mw/cmZ；(

9、5)激光照射時間為3min。2小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞集落形成：單純Rh 123及單純激光照射對cFU一GM集落形成的影響無顯著差異。光動力學(xué)組中,30 mw/c mZ以下照射劑量對cFu一GM集落無明顯影響；50 mw/c mZ以上照射劑量明顯抑制CFU一GM集落形成。3光動力學(xué)療法對小鼠T淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)CD69+表達的影響：光動力學(xué)處理后,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系的 CD3+CD69+表達明顯下降(P<；0.05)。4光動力學(xué)療法

10、對宿主抗原特異反應(yīng)的人淋巴細(xì)胞的選擇性滅活：將經(jīng)過光動力學(xué)處理后的混合淋巴細(xì)胞分組,分別加入第一次混合培養(yǎng)時的同一宿主刺激細(xì)胞A或另加入一新的外來異基因刺激細(xì)胞C；分別再繼續(xù)培養(yǎng)24h,當(dāng)激光功率密度為30mw/c mZ時,光動力學(xué)處理細(xì)胞+原宿主刺激細(xì)胞A組的A570值明顯低于光動力學(xué)處理后細(xì)胞+新刺激細(xì)胞C組(P<；0.05)。5光動力學(xué)療法預(yù)防小鼠異基因骨髓移植中aGVHD的實驗：生理鹽水組小鼠均于15d內(nèi)死亡。同基因骨髓+同

11、基因脾臟淋巴細(xì)胞移植組100%存活,異基因骨髓+異基因脾臟淋巴細(xì)胞移植組(aGVHD組)自第1 ld開始出現(xiàn)典型的aGVHD表現(xiàn),在22d內(nèi)死亡。光動力學(xué)治療組也不同程度出現(xiàn)以上aGVHD表現(xiàn),但臨床表現(xiàn)及病理程度減輕,且存活小鼠數(shù)量增多,aGVHD組和光動力學(xué)組間生存率有顯著差異(P<；0.05)。結(jié)論u建立光動力學(xué)療法實驗條件：(l)以氫離子激光器為光源,Rh123為光敏劑；(2) Rhl23孵育濃度為50 tunol幾；(3