光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤免疫及微血管效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 觀察光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)對(duì)荷Heps肝癌移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及生存期、腫瘤局部及全身免疫效應(yīng)、腫瘤微血管及腫瘤細(xì)胞促血管生成因子表達(dá)的影響，探討PDT的免疫和微血管效應(yīng)機(jī)制，為臨床肝癌PDT提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。觀察PDT聯(lián)合CpG寡聚脫氧核苷酸(cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides，CpG ODN)局部治療，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及免疫效應(yīng)的

2、影響，探討聯(lián)合治療的療效和作用機(jī)制，為肝癌綜合治療提供新方法。 方法: 接種Heps肝癌細(xì)胞于ICR小鼠皮下，建立Heps肝癌移植瘤模型。移植瘤長(zhǎng)徑達(dá)0.9～1.2cm時(shí)，隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組、免疫治療組、PDT組和光動(dòng)力免疫治療(photodynamic immunotherapy，PDIT)組，每組均為28只小鼠。免疫治療組于小鼠腫瘤局部注射CpG ODN100μg。PDT組于治療前1日經(jīng)小鼠尾靜脈注入光敏劑PSD-007 2

3、0mg/kg，避光24小時(shí)后照射腫瘤局部。激光波長(zhǎng)632.8nm，光斑直徑2cm，功率密度為240～250mW/cm2，能量密度為215～225J/cm2。PDIT組于PDT后即刻腫瘤局部注射CpG ODN100 μg。(1) 自治療當(dāng)日起，隔日測(cè)量四組小鼠腫瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算腫瘤體積和治療后16天的抑瘤率。(2) 記錄接種腫瘤當(dāng)天開(kāi)始至小鼠死亡的時(shí)間，計(jì)算各組小鼠平均生存時(shí)間。(3) 于治療后2小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)，各組分批

4、處死5只小鼠。取腫瘤組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin，HE)染色后光學(xué)顯微鏡觀察。(4) 取各組小鼠上述時(shí)間點(diǎn)的腫瘤組織切片，分別應(yīng)用F4/80抗體、CD8抗體、CD34抗體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體，行免疫組織化學(xué)染色。計(jì)數(shù)局部腫瘤組織中巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞數(shù)量和微血管密度(microvessel density，

5、MVD)值，并應(yīng)用圖像分析軟件，對(duì)腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。(5) 取各組小鼠上述時(shí)間點(diǎn)的血清，通過(guò)雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，檢測(cè)干擾素(interferon，IFN)-γ和白介素(interleukin，IL)-12p70的水平。 結(jié)果: 1.免疫治療組治療后8天、16天，腫瘤體積較荷瘤對(duì)照組明顯縮小(P<0.01)。P

6、DT組和PDIT組治療后48小時(shí)，腫瘤體積即較荷瘤對(duì)照組明顯縮小(P<0.05)；治療后8天、16天，腫瘤體積較荷瘤對(duì)照組及免疫治療組均顯著縮小(P<0.01)。PDIT組治療后8天及16天，腫瘤體積較PDT組縮小更為顯著(P<0.05)。免疫治療組、PDT組和PDIT組治療后16天的抑瘤率，分別為19.20％、96.26％、97.76％。 2.荷瘤對(duì)照組、免疫治療組、PDT組和PDIT組小鼠平均生存時(shí)間，分別為22.50±6.

7、48天、24.75±9.32天、72.25±12.23天、80.00±13.91天。免疫治療組小鼠生存時(shí)間，較荷瘤對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。PDT組和PDIT組小鼠生存時(shí)間，較荷瘤對(duì)照組及免疫治療組均明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。PDIT組小鼠生存時(shí)間，較PDT組稍有延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.HE染色結(jié)果顯示，荷瘤對(duì)照組腫瘤細(xì)胞呈巢片狀生長(zhǎng)，壞死區(qū)少見(jiàn)，腫瘤組織中浸潤(rùn)少量炎癥細(xì)胞。免疫治療組治療后2小時(shí)

8、、6小時(shí)，腫瘤壞死較荷瘤對(duì)照組無(wú)明顯變化；治療后24小時(shí)、72小時(shí)，見(jiàn)小片狀壞死區(qū)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較荷瘤對(duì)照組增多。PDT組治療后2小時(shí)腫瘤細(xì)胞主要為空泡樣變性，微血管擴(kuò)張淤血；治療后6小時(shí)腫瘤細(xì)胞空泡樣變性、核固縮較前加重，微血管高度擴(kuò)張，血液淤滯；治療后24小時(shí)腫瘤細(xì)胞大片壞死，微血管破壞，腫瘤組織間可見(jiàn)彌散出血；治療后72小時(shí)腫瘤組織大片凝固性壞死，微血管完全破壞，僅周邊區(qū)域見(jiàn)少數(shù)殘存微血管，周圍環(huán)繞變性腫瘤細(xì)胞，腫瘤組織中可見(jiàn)大量炎

9、癥細(xì)胞浸潤(rùn)。PDIT組治療后72小時(shí)，腫瘤細(xì)胞壞死情況和微血管變化與PDT組相似，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯。 4.免疫組化染色結(jié)果顯示，免疫治療組治療后24小時(shí)、72小時(shí)，腫瘤局部巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于荷瘤對(duì)照組(P<0.01)。PDT組治療后2小時(shí)、6小時(shí)及72小時(shí)，PDIT組治療后2小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)，腫瘤局部巨噬細(xì)胞數(shù)量，較荷瘤對(duì)照組及免疫治療組均明顯增多(P<0.01或P<0.05)。PDT組治療后24小時(shí)，腫瘤

10、局部巨噬細(xì)胞較6小時(shí)有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，仍明顯高于荷瘤對(duì)照組(P<0.01)。上述時(shí)間點(diǎn)，PDIT組腫瘤局部巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著高于PDT組(P<0.01或P<0.05)。 免疫治療組治療后72小時(shí)，癌巢內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量，較荷瘤對(duì)照組明顯增多(P<0.01)。PDT組也于治療后72小時(shí)，癌巢內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增多，與荷瘤對(duì)照組和免疫治療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01).PDI

11、T組治療后72小時(shí)，癌巢內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量，較荷瘤對(duì)照組、免疫治療組和PDT組均明顯增多(P<0.05或P<0.01). PDT后2小時(shí)～72小時(shí)，腫瘤區(qū)MVD進(jìn)行性下降。治療后2小時(shí)，腫瘤MVD即明顯低于荷瘤對(duì)照組(P<0.01)；治療后6小時(shí)較2小時(shí)有所下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后24小時(shí)，腫瘤MVD較6小時(shí)顯著降低(P<0.05)；治療后72小時(shí)，殘存微血管數(shù)量極少。 PDT后2小時(shí)～72小時(shí)，

12、腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)較荷瘤對(duì)照組明顯升高(P<0.01).治療后6小時(shí)，腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)強(qiáng)度達(dá)最高值，顯著高于治療后2小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。 5.ELISA結(jié)果顯示，免疫治療組治療后24小時(shí)、72小時(shí)，血清IL-12p70的濃度較荷瘤對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；治療后72小時(shí)，血清IFN-γ的濃度較荷瘤對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。PDT組和PDIT組治療后2小時(shí)～72小

13、時(shí)，血清IL-12p70的濃度，顯著高于荷瘤對(duì)照組和免疫治療組(P<0.01)。PDT組治療后72小時(shí)，PDIT組治療后24小時(shí)、72小時(shí)，血清IFN-γ的濃度也較荷瘤對(duì)照組和免疫治療組明顯升高(P<0.01或P<0.05)。PDIT組較PDT組升高更為顯著(P<0.01或P<0.05)。 結(jié)論: 1.PDT可有效殺傷肝癌細(xì)胞，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。 2.PDT可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)