RNA干擾抑制豬肉內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)及其多克隆抗體制備的研究.pdf

1、第一部分:
　　 兔抗豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒P15E多克隆抗體的制備
　　 研究背景和目的:
　　 豬器官、組織和細(xì)胞作為臨床移植的供體源具有廣泛和良好的應(yīng)用前景，可緩解臨床器官移植的器官相對(duì)短缺;也可為臨床治療1型胰島素依賴型糖尿病，帕金森病、亨廷頓病和癲痛病等頑固性神經(jīng)疾患提供一種治療方法。豬肝細(xì)胞也可作為豬肝細(xì)胞型生物人工肝的生物成分治療急性爆發(fā)性肝炎肝功能衰竭和終末期肝功能衰竭的過渡性措施。自Dr.Clive

2、patienee(BioTransplantxnc.首席科學(xué)家)1997年報(bào)道豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcineendogenousretrovirus，PERV)感染體外培養(yǎng)人源細(xì)胞以來，豬異種移植或豬肝細(xì)胞型生物人工肝治療過程中可能發(fā)生PERV種間傳播的潛在危險(xiǎn)引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。
　　 Patience等首先證實(shí)至少有三種PERV亞型在體外培養(yǎng)能夠感染人源細(xì)胞，Takeuchi和Martin等也證實(shí)PERV可以感染體外

3、培養(yǎng)的人源細(xì)胞株。
　　 1998年，DennerJ等報(bào)道逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白即跨膜蛋白P15E是一個(gè)活性成分，在體內(nèi)和體外可以抑制免疫反應(yīng);P15E的檢測(cè)可以作為檢測(cè)PERV表達(dá)及其是否具有感染性的一個(gè)診斷指標(biāo)。國(guó)內(nèi)及國(guó)際抗體市場(chǎng)上并未見應(yīng)用于檢測(cè)PERVP15E的特異性抗體，本研究在國(guó)外報(bào)道的PERVP15E抗原位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并制作了兔抗豬PERVP15E多克隆抗體，該抗體用于檢測(cè)PERVP15E在蛋白方面的表達(dá)水平

4、具有很高的靈敏度及特異性。該抗體的研發(fā)，對(duì)檢測(cè)臨床器官移植和豬肝細(xì)胞型生物人工肝中PERV的表達(dá)和傳播具有重要意義。
　　 方法:
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告獲得了PERVP15E抗原表位E1和E2蛋白序列，再根據(jù)其蛋白序列反推獲得了P15EE1和E2的核酸序列。P15E核酸序列最小長(zhǎng)度317bp，為增強(qiáng)其抗原性以及表位的完整性，我們將P15E前方100bp核酸序列一起擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到了P15E編碼區(qū)序列，然后將

5、其連接到PGEX-4T-1載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，再通過自身誘導(dǎo)法誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒的融合蛋白通過割膠回收純化融合蛋白。免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，Westernblot和ELISA檢測(cè)抗體活性和滴度。
　　 結(jié)果:
　　 兔抗豬PERVP15E多克隆抗體可以特異性檢測(cè)P15E抗原蛋白以及豬腎細(xì)胞系PK15中P15E蛋白的表達(dá)，而人腎細(xì)胞系HEK293中則檢測(cè)不到該蛋白表達(dá)，證實(shí)本抗體特異性強(qiáng)。EL