植物病毒沉默抑制子P25的原核表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、馬鈴薯X病毒(potatovirusX，PVX)的P25蛋白是參與病毒在細(xì)胞和細(xì)胞之間運(yùn)動(dòng)的一個(gè)重要蛋白，它在轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默中起到抑制作用，能夠提高PVX病毒侵染植物的成功率。本研究對(duì)植物病毒沉默抑制子P25進(jìn)行原核表達(dá)、純化并制備該抑制子的多克隆抗體，為下一步研究抑制子在基因沉默中的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。通過(guò)體外DNA重組技術(shù)，將來(lái)源于pBIN61-p25質(zhì)粒上的目的基因p25片段在T4DNA連接酶的作用下，插入到原核表達(dá)載體pET

2、-28a(+)的BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-p25。經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切鑒定以及DNA序列分析，插入的目的基因p25的序列正確，N端與6×His標(biāo)簽形成融合蛋白，無(wú)移碼現(xiàn)象。將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-p25轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，加入終濃度為1.0mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后表達(dá)出分子量大約

3、為28.6kDa的P25融合蛋白。該P(yáng)25融合蛋白以可溶形式存在，擴(kuò)大培養(yǎng)按1∶40的比例濃縮后在變性條件下經(jīng)Ni離子親和層析得到純品P25融合蛋白。用Bradford法測(cè)定給該融合蛋白含量達(dá)180μg/ml。用純化的P25融合蛋白免疫三只6-8周齡的BALB/c小鼠(15μg/只，次)三次后，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，獲得的P25融合蛋白的多克隆抗體以1∶12000的比例稀釋后仍可檢測(cè)到0.25μg左右的抗原(融合蛋白P25)。P25融合蛋