高甲基化抑癌基因HIC1在前列腺癌發(fā)展中作用.pdf

1、目的:
　　探討高甲基化抑癌基因HIC1在前列腺癌發(fā)展中的作用及分子機制。
　　方法:
　　(1)采用甲基化特異性PCR(MSP),亞硫酸鹽測序PCR(BSP)技術,對前列腺癌細胞和臨床標本進行HIC1啟動子甲基化分析,并分析經5-Aza-CdR處理前列腺癌細胞后的HIC1啟動子甲基化狀態(tài);采用RT-PCR和Westem blot分析前列腺癌細胞中HIC1表達水平。
　　(2)建立HIC1過表達前列腺癌細胞株PC

2、3HIC1、C4-2BHIC1和相應對照株PC3GFP、C4-2BGFP,采用流式細胞儀和體外細胞侵襲等功能實驗檢測前列腺癌的體外侵襲轉移能力。在SCIDd小鼠體內注射PC3HIC1、C4-2BHIC1與對照株,分析形成腫瘤大小;進行小鼠骨X成像、大腿脛骨TRAP染色和小動物Luciferase活體成像,分析HIC1過表達后對前列腺癌形成和轉移能力影響的差異。
　　(3)對細胞株PC3HIC1、C4-2BHIC1和對照株進行基因芯

3、片實驗,發(fā)現(xiàn)受HIC1調控的差異基因表達譜;采mRT-qPCR、Western blot和流式細胞儀分別對潛在的下游靶基因CXCR-7、E-cadherin、Vimentin和Snail的表達變化進行驗證。進行Luciferase報告基因和染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗,分析在前列腺癌細胞PC3和C4-2B中,HIC1是否和CXCR7的啟動子區(qū)域進行結合;采用免疫組化實驗(IHC)分析注射前列腺癌細胞的SCID小鼠成瘤組織,組織芯片實

4、驗分析前列腺癌臨床組織標本,驗證HIC1是否抑制了CXCR7的表達:使用Westernblot和流式細胞儀分析用5-Aza-cdR處理PC3和C4-2B細胞后,HIC1和CXCR7的表達。進行Westem blot實驗分析PC3HIC1、C4-2BHIC1細胞與對照株,IHC分析注射前列腺癌細胞的SCID小鼠的成瘤組織,驗證HIC1過表達后與上皮-間質轉化(epithelial-mesenchyrmal transition,EMT)有

5、關蛋白質的表達變化。
　　結果:
　　(1)使用在線分析軟件Methprimer預測HIC1基因1亞型轉錄起始點上游-1,000bp區(qū)域內存在3個CpG島。進行MSP和BSP測序,發(fā)現(xiàn)在PC3和C4-2B細胞中,HIC1啟動子存在高度甲基化,而在正常前列腺上皮細胞PrEC中,HIC1啟動子甲基化程度很低;檢測36例人前列腺癌實體瘤和36例人前列腺正常穿刺組織,發(fā)現(xiàn)HIC1甲基化比例分別是80.3％和31.56％,有明顯差異;

6、用5-Aza-CdR處理前列腺癌細胞株后,發(fā)現(xiàn)HIC1啟動子甲基化明顯降低,未甲基化趨勢上升,而HIC1轉錄和蛋白表達水平均顯著上調。
　　(2)PC3HIC1、C4-2BHIC1與對照株比較,應用流式細胞儀和體外細胞侵襲等功能實驗,發(fā)現(xiàn)生長速度明顯減慢,凋亡率明顯增高,細胞遷移能力明顯下降,侵襲功能受到顯著抑制;體外成瘤實驗發(fā)現(xiàn)SCID小鼠成瘤能力降低。PC3HIC1與對照株比較,X成像和TRAP染色結果顯示骨損毀程度顯著減弱,

7、小動物Luciferase活體成像顯示骨轉移功能明顯減弱。
　　(3)PC3HIC1、C4-2BHIC1。分別與對照株比較,進行基因芯片實驗,發(fā)現(xiàn)一些下游基因CXCR7、Vimentin和Snail表達受到明顯抑制,而E-Cadherin等基因上調表達顯著;通過RT-qPCR,Western blot和流式細胞儀發(fā)現(xiàn)除CXCR7被下調表達外,與EMT有關的信號通路蛋白的表達發(fā)生了改變。深入采用Luciferase報告基因和ChIP

8、實驗,證實在前列腺癌細胞中,HIC1與CXCR7啟動子發(fā)生了結合,抑制了CXCR7活性;在CXCR7啟動子中突變其潛在的結合位點(HIC1應答元件,HiRE),HIC1介導的抑制性顯著降低。進行IHC分析注射前列腺癌細胞的SCID小鼠的成瘤組織,組織芯片實驗分析前列腺癌組織,驗證了HIC1抑制了CXCR7表達;采用Western blot和流式細胞儀分析用5-Aza-cdR處理后的PC3和C4-2B細胞,恢復HIC1表達顯著,抑制了CX

9、CR7的表達水平。進行Westem blot實驗分析PC3HIC1、C4-2BHIC1細胞與對照株,發(fā)現(xiàn)HIC1過表達后,E-Cadherin和Vimentin蛋白的表達發(fā)生改變,p-AKT(Ser473)和Snail蛋白表達下調。IHC分析驗證HIC1過表達后,E-Cadherin蛋白表達上調,Vimentin蛋白表達下調。
　　結論:
　　(1)在前列腺癌中,抑癌基因HIC1的啟動子存在高度甲基化,導致HIC1表達被沉默

10、或下調。
　　(2)恢復HIC1表達,顯著抑制前列腺癌細胞在體外增殖、遷移、轉移能力和體內成瘤、骨轉移和骨損傷。
　　(3)CXCR7是HIC1調控的重要下游靶基因,HIC1蛋白與CXCR7啟動子結合,特異性介導對CXCR7的抑制作用。在前列腺癌中,HIC1啟動子高度甲基化使其表達下調,降低了對CXCR7的抑制作用,可能在前列腺癌的發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　(4)HIC1可能介導EMT的發(fā)生,與前列腺癌發(fā)展存在相關性。