前列腺癌基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析.pdf

1、前列腺癌(prostatecancer，PC)為全世界男性最常見(jiàn)的癌癥之一，在美國(guó)男性所有診斷出來(lái)的腫瘤當(dāng)中PC占了1/3，病死率排第二，僅次于肺癌，近年來(lái)PC在中國(guó)的發(fā)病率也呈不斷上升趨勢(shì)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞和分子水平的變化有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因改變的結(jié)果，在這過(guò)程中有多種原癌基因被激活以及抑癌基因失活，癌的發(fā)生、發(fā)展就是原癌基因、抑癌基因以及生長(zhǎng)因子調(diào)控失調(diào)的結(jié)果，前列

2、腺癌的發(fā)生也不例外。但是前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程十分復(fù)雜，呈現(xiàn)多步驟、多基因復(fù)合的特點(diǎn)，目前人們對(duì)其涉及的機(jī)制還知之甚少?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一開(kāi)始前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有依賴(lài)雄激素的生物學(xué)特性，多數(shù)前列腺癌患者在首次接受雄激素剝奪療法后都有顯著療效，但最后超過(guò)一半的患者會(huì)復(fù)發(fā)并由雄激素依賴(lài)型前列腺癌發(fā)展成高度惡化且廣泛轉(zhuǎn)移的雄激素非依賴(lài)型前列腺癌，使常規(guī)的雄激素剝奪治療失去效果，而前列腺癌細(xì)胞激素依賴(lài)型發(fā)生變化，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和對(duì)抗內(nèi)雄激素剝奪治

3、療，從而導(dǎo)致臨床患者病情惡化并最終導(dǎo)致死亡的主要原因。前列腺癌形成的基因改變有不少報(bào)道，但對(duì)雄激素非依賴(lài)型前列腺癌的形成機(jī)制還不清楚且報(bào)道不多，基因芯片技術(shù)對(duì)PC在雄激素剝奪治療前后的基因表達(dá)改變分析也許對(duì)了解雄激素非依賴(lài)型前列腺癌的形成過(guò)程可以提供一些線索。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件GeneSifter對(duì)來(lái)自基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GeneExpressionOmnibus(GEO)的12個(gè)雄激素依賴(lài)型前列腺癌和雄激素非依賴(lài)型前列腺癌基因表

4、達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)作進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，以了解PC在雄激素剝奪治療后的基因表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討雄激素非依賴(lài)型前列腺癌形成的分子機(jī)理。 本文屬于基因芯片生物信息學(xué)的內(nèi)容，探索利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO所貯存的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)并結(jié)合一些生物學(xué)知識(shí)對(duì)雄激素非依賴(lài)型前列腺癌形成機(jī)理作進(jìn)一步推測(cè)分析，以期為闡明雄激素非依賴(lài)型前列腺癌形成的分子機(jī)制提供一些基因表達(dá)方面的線索，并為進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。本研究按順序分三部分： 第一

5、部分：對(duì)基因芯片與數(shù)據(jù)分析作了綜述，先對(duì)基因芯片的基本原理、單通道和雙通道實(shí)驗(yàn)、基因芯片的種類(lèi)和應(yīng)用作了敘述；然后對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)的處理、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與平臺(tái)的選擇、差異基因表達(dá)、聚類(lèi)分析和生物學(xué)意義分析作了敘述； 第二部分：詳細(xì)介紹了基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO的構(gòu)成、查詢和一些分析工具的使用?；蛐酒膹V泛應(yīng)用，產(chǎn)生了海量的數(shù)據(jù)，為基因研究提供大量高通量數(shù)據(jù)資料。為有效地組織、存取、管理如此大量的基因數(shù)據(jù)信息，迫切需要一個(gè)統(tǒng)一管理

6、的公共數(shù)據(jù)庫(kù)、建立一種通用的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)格式，使數(shù)據(jù)能更好地與其它信息資源比較分析。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室和機(jī)構(gòu)開(kāi)始試圖組建網(wǎng)上資源來(lái)散布這些高通量數(shù)據(jù)集，隸屬于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)，開(kāi)始了一個(gè)基因表達(dá)匯編計(jì)劃，即：基因表達(dá)綜合庫(kù)(GeneExpressionOmnibus，GEO)，以便更好的支持公共使用和散布基因表達(dá)數(shù)據(jù)。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)創(chuàng)建于2000年，是當(dāng)

7、今最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源，至今已存儲(chǔ)了214，268個(gè)樣本，8300個(gè)記錄，4500個(gè)平臺(tái)。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋廣泛的生物學(xué)內(nèi)容，包括疾病、代謝、藥理學(xué)、藥學(xué)、免疫學(xué)和生態(tài)學(xué)等。數(shù)據(jù)來(lái)自世界各地實(shí)驗(yàn)室研究者的提交，有些雜志要求文章發(fā)表時(shí)將數(shù)據(jù)提交到一些公共數(shù)據(jù)庫(kù)，其目的是可以讓一些獨(dú)立的研究機(jī)構(gòu)來(lái)重新評(píng)價(jià)和分析這些數(shù)據(jù)的結(jié)果。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)及其工具，也可以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，或提供支持性意見(jiàn)，或設(shè)計(jì)研究計(jì)劃及其獲得假說(shuō)的否定證據(jù)

8、等。GEO數(shù)據(jù)的再分析和重新解釋還可以為其它領(lǐng)域提供一些有價(jià)值的線索。隨著GEO數(shù)據(jù)庫(kù)在大小和多樣性方面的不斷增長(zhǎng)，這樣的研究發(fā)現(xiàn)機(jī)遇也將不斷提高。 第三部分：應(yīng)用基因芯片數(shù)據(jù)分析工具GeneSifter對(duì)前列腺癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)一些差異表達(dá)的基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體和KEGG通路分析。前列腺癌抗雄激素治療后，前列腺癌由激素依賴(lài)型向激素非依賴(lài)型的轉(zhuǎn)化，這是困擾多年的問(wèn)題。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程包含多種分

9、子的改變，這些改變可以通過(guò)前列腺癌細(xì)胞基因表達(dá)的變化來(lái)反映。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，采用基因芯片技術(shù)分析腫瘤細(xì)胞在不同發(fā)展階段的基因調(diào)節(jié)，根據(jù)基因表達(dá)方式對(duì)腫瘤患者進(jìn)行分類(lèi)并實(shí)施個(gè)體化治療，是前列腺癌研究的方向。國(guó)際上諸多學(xué)者通過(guò)對(duì)前列腺癌基因表達(dá)譜的分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些新的前列腺癌異常表達(dá)基因，為前列腺癌分子標(biāo)志物的最終判定及選擇相應(yīng)的靶序列進(jìn)行基因治療奠定了基礎(chǔ)。本研究所用到的芯片數(shù)據(jù)平臺(tái)是GPL96，也稱(chēng)人類(lèi)基因組HG-U133

10、A芯片集，是艾菲公司(Affymetrix)的產(chǎn)品，它包含45000個(gè)探針集代表超過(guò)39000個(gè)轉(zhuǎn)錄本來(lái)源于大概33000個(gè)充分證實(shí)過(guò)的人類(lèi)基因，至今在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)已有15932個(gè)樣本使用這個(gè)平臺(tái)。基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)來(lái)自GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)由BESTCJ等提交的GDS1390數(shù)據(jù)集GSE2443系列20個(gè)樣品芯片數(shù)據(jù)中選取12個(gè)GSM，其編號(hào)分別是：GSM45850，GSM45851，GSM45852，GSM45853，GSM45854，G

11、SM45855，GSM45860，GSM45861，GSM45862，GSM45863，GSM45864，GSM45865。前6個(gè)數(shù)據(jù)的標(biāo)本是雄激素依賴(lài)型前列腺癌患者于雄激素剝奪治療前行前列腺切除術(shù)取得并經(jīng)過(guò)病理學(xué)鑒定；后面6個(gè)數(shù)據(jù)的標(biāo)本是雄激素非依賴(lài)型前列腺癌患者原位腫瘤活檢組織取得，所有標(biāo)本經(jīng)處理后采用激光捕獲顯微切割(LCM)方法取得的細(xì)胞經(jīng)RNA提取、擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄和熒光標(biāo)記等步驟，最后與AffymetrixHumanGenome

12、U133A芯片雜交，經(jīng)AffymetrixGeneChipScanner3000掃描儀掃描得到原始數(shù)據(jù)上傳到GEO數(shù)據(jù)庫(kù)。從GeneSifter對(duì)雄激素依賴(lài)型前列腺癌和雄激素非依賴(lài)型前列腺癌兩組表達(dá)譜數(shù)據(jù)差異分析結(jié)果看，表達(dá)差異基因篩選得到348個(gè)基因中有108個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，240個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，其中有一些基因以前有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)與腫瘤有關(guān)，如Bcl-2、Tetraspanin1、GALNT12，其中表達(dá)最具顯著意義的是GREB1prot

13、ein基因，下調(diào)表達(dá)達(dá)到15.48倍，是表達(dá)倍數(shù)最高的基因，GREB1(generegulatedbyestrogeninbreastcancerl)是雌激素應(yīng)答基因，在乳腺癌研究中被認(rèn)為在腫瘤對(duì)激素反應(yīng)中有重要的作用，此次發(fā)現(xiàn)在雄激素非依賴(lài)型前列腺癌中顯著低表達(dá)，提示其對(duì)前列腺癌在激素剝奪治療后可能也有重要的作用。通過(guò)GeneSifter自帶的GO生物學(xué)過(guò)程分析和KEGG通路分析，得到比較有意思的結(jié)果是在細(xì)胞黏附以及細(xì)胞通訊相關(guān)的基因

14、表達(dá)有顯著的變化，提示細(xì)胞黏附過(guò)程可能與前列腺癌相關(guān)。相鄰細(xì)胞間的連接決定細(xì)胞和組織的形態(tài)、調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)、分化和存活等。細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)(adherenjunction)的形成是通過(guò)相鄰細(xì)胞表面的鈣依賴(lài)型鈣黏著素受體的細(xì)胞外區(qū)域的相互作用實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞的惡變通常表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)中細(xì)胞骨架的根本改變，一方面通過(guò)下調(diào)鈣黏素或連環(huán)蛋白(catenin)家族成員的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，另一方面可以通過(guò)激活一些可阻斷細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)聚集的信號(hào)傳導(dǎo)途徑