枸杞多糖的制備及其活化巨噬細(xì)胞機(jī)理的研究.pdf

1、枸杞是我國(guó)重要的植物資源,尤其以寧夏枸杞最為著名.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床研究認(rèn)為,從枸杞中提取的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBPs)是枸杞生物學(xué)作用的主要有效成份之一,它由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和木糖等6種單糖組成.枸杞多糖具有延緩衰老,抗氧化;抗腫瘤,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;降血糖,降血脂;免疫調(diào)節(jié)和抗輻射等生物學(xué)功能. 巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)

2、節(jié)等重要作用.激活的巨噬細(xì)胞除了可以直接殺傷病原微生物,清除凋亡細(xì)胞和突變細(xì)胞外,其分泌的腫瘤壞死因子-a(17NF-a)、白介素.1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、粒一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、一氧化氮(NO)等免疫活性分子在先天性免疫防御和獲得性免疫應(yīng)答中更是起著不可忽視的作用. 本課題主要研究枸杞多糖激活巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制,具體分為兩個(gè)部分,第一部分以寧夏中寧枸杞為原料,采用熱水浸提法制得枸杞浸提液,運(yùn)用

3、超濾法分級(jí)分離枸杞多糖,得到不同分子量范圍的三個(gè)多糖級(jí)分,硫酸苯酚法測(cè)定糖含量后,以RAW264.7細(xì)胞NO,TNF-a及GM-CSF的釋放量為指標(biāo),觀察三個(gè)級(jí)分對(duì)巨噬細(xì)胞的活化作用. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:100g枸杞經(jīng)脫脂,熱水浸提,脫色,除蛋白,超濾得分子量范圍5KD.30KD、30KD-50KD、大于50KD三個(gè)級(jí)分枸杞多糖,質(zhì)量分別為2.6g、2.0g、3.2g,硫酸苯酚法測(cè)定糖含量分別為74.3﹪,69.8﹪,78.4﹪.G

4、riess法測(cè)NO產(chǎn)量及ELISA法測(cè)細(xì)胞因子結(jié)果顯示:分子量5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三個(gè)級(jí)分枸杞多糖均能不同程度地促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO,后兩者還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-a及GM-CSF. 本試驗(yàn)得出的結(jié)論:超濾法可以簡(jiǎn)單、快速、有效地對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分離,所得的5KD-30KD、30KD-50KD、大于50KD三個(gè)級(jí)分對(duì)RAW264.7細(xì)胞均有不同程度活化作用,其中以大于50KD級(jí)分作用最為顯著.

5、 第二部分以小鼠單核/巨噬類(lèi)細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象,觀察從美國(guó)泛華公司購(gòu)買(mǎi)的枸杞多糖作用于巨噬細(xì)胞對(duì)其釋放細(xì)胞因子NO以及iNOS活性水平的影響,并初步探討了Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(NF-κB)信號(hào)通路在這過(guò)程中的作用,旨在部分解釋枸杞多糖對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的機(jī)制,為其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供理論依據(jù).實(shí)驗(yàn)中采用Griess還原法研究枸杞多糖對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO的作用以及NF-κB抑制劑和TLR4抗

6、體對(duì)枸杞多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO作用的影響,用誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)檢測(cè)試劑盒測(cè)定胞質(zhì)內(nèi)iNOS的活性,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的變化. 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用200μg/ml劑量的枸杞多糖作用于RAW264.7細(xì)胞6h即可明顯誘導(dǎo)NO的生成,6～18h之間NO釋放的速度迅速增加,24h后NO的釋放開(kāi)始減少.實(shí)驗(yàn)中以單純用全細(xì)胞培養(yǎng)液孵育的巨噬細(xì)胞作為陰性對(duì)照,以10μg/ml的脂多糖予以刺激的細(xì)胞作為陽(yáng)

7、性對(duì)照組.以10、50、200、500μg/ml劑量的枸杞多糖分別作用于RAW264.7細(xì)胞18h,可以觀察到與對(duì)照組相比,10μg/ml枸杞多糖即能明顯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生,且隨著劑量的增加,NO的產(chǎn)量不斷增加,iNOS的活性不斷增強(qiáng).用TLR4抗體預(yù)孵育RAW264.7細(xì)胞1h,更換培養(yǎng)液后再加200μg/ml枸杞多糖予以刺激18h,發(fā)現(xiàn)TLR4抗體能抑制枸杞多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的產(chǎn)生.Western blot結(jié)果顯

8、示200μg/ml枸杞多糖作用于RAW264.7細(xì)胞6h,胞核內(nèi)p65的含量明顯增加,8h時(shí)達(dá)到高峰,10h活化程度開(kāi)始減弱.另外,NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)作用于RAW264.7細(xì)胞90min,然后加入200μg/ml劑量的枸杞多糖對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激,發(fā)現(xiàn)PDTC在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、12、18、24h)都明顯抑制枸杞多糖對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO的誘導(dǎo)作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示LPS的特殊抑制劑多粘菌素B(PMB)與枸杞多糖聯(lián)