MMPs抑制劑和手法治療對大鼠腰椎間盤組織退變影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下兩部分展開： 第一部分：外源性MMPs抑制劑—四環(huán)素、手法對造模大鼠腰椎間盤組織退變的形態(tài)學(xué)影響 目的：探討外源性MMPs抑制劑—四環(huán)素、手法對造模大鼠腰椎間盤組織退變的形態(tài)學(xué)影響，試圖從影像學(xué)和形態(tài)學(xué)角度闡明它們對椎間盤早期退變抑制的作用機(jī)理。 方法：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)平均地分為四組：正常組、對照組、四環(huán)素組、手法組。將它們分別單籠飼養(yǎng)，并且使對照組、四環(huán)素組、手法組造模。動物模型建立4周后

2、，正常組和對照組皮下注射生理鹽水，四環(huán)素組每日皮下注射四環(huán)素25 mg，持續(xù)2周。手法組的大鼠腰椎進(jìn)行手法治療約10分鐘。分別于于造模前、造模后第2、8周每組隨機(jī)選取3只動物麻醉后CR拍片檢查。動物模型建立4周后，在進(jìn)行第一次注射藥物和手法干預(yù)前，每組隨機(jī)選取3只動物，給予10％水合氯醛腹腔注射麻醉，拍攝腰椎X線正側(cè)位片，造模達(dá)8周，以過量10％水合氯醛腹腔注射麻醉將其處死，迅速從腰椎后正中線切開皮膚，逐層分離腰椎兩旁的肌肉韌帶，直達(dá)椎

3、體。取下整個腰椎段脊柱迅速放在冰面上，用眼科剪刀、鑷剝離椎間小關(guān)節(jié)和椎體前方的軟組織，分別從L1椎體下緣和L2椎體上緣分離上、下軟骨終板，取出L1/2椎間盤組織。用同樣的方法取出L2/3、L3/4、L4/5、L5/6椎間盤組織，用于其它實(shí)驗(yàn)。將取下的L1/2椎間盤組織放入4％多聚甲醛中固定，5％硝酸中脫鈣，常規(guī)處理后，石蠟包埋，正中冠狀切片，5um厚，HE染色。在日本OLYMPUS公司倒置顯微鏡IX71及顯微成像系統(tǒng)DP71—IPP6.

4、0下觀察。 結(jié)果：兩個月后，觀察大鼠腰椎X線結(jié)果，四環(huán)素組干預(yù)后較另兩組椎間隙變窄，脊柱腰段變直，部分椎體前下角骨皮質(zhì)增生硬化，部分椎間孔變?。皇址ńM干預(yù)后較另兩組生理彎曲圓滑，椎間隙無明顯改變，部分上段腰椎椎間孔有狹窄；對照組干預(yù)后生理彎曲存在，部分椎體前下角骨質(zhì)硬化。光鏡下，與正常組相比，四環(huán)素組、手法組無明顯變化，髓核位于中心，無固縮，外周被纖維環(huán)包繞；對照組髓核稍有固縮。 結(jié)論：造模兩個月后，X線影像學(xué)表現(xiàn)與造模

5、前比較有明顯改變，其組織結(jié)構(gòu)有向退變方向發(fā)展趨勢，說明大鼠腰椎間盤開始發(fā)生輕度退變，并處于退變的早期階段。從X線影像學(xué)和組織形態(tài)學(xué)來看，外源性MMPs抑制劑—四環(huán)素、手法具有維護(hù)腰椎結(jié)構(gòu)和改善早期退變階段椎間盤組織結(jié)構(gòu)的作用。 第二部分：MMPs抑制劑和手法治療對大鼠腰椎間盤組織退變影響的基因表達(dá)研究 目的：探討外源性MMPs抑制劑—四環(huán)素、手法對造模大鼠腰椎間盤組織退變基因表達(dá)的影響，試圖從基因水平闡明它們對椎間盤早期

6、退變抑制的作用機(jī)理，為臨床進(jìn)一步量化手法治療效果和規(guī)范手法治療方法提供理論依據(jù)。 方法：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)平均地分為四組：正常組、對照組、四環(huán)素組、手法組。將它們分別單籠飼養(yǎng)，對照組、四環(huán)素組、手法組實(shí)驗(yàn)動物造模。動物模型建立4周后，正常組和對照組皮下注射生理鹽水，四環(huán)素組每日皮下注射四環(huán)素25 mg，持續(xù)2周。手法組的大鼠腰椎進(jìn)行手法治療約10分鐘。分別于造模前、造模后第2、8周每組隨機(jī)選取3只動物麻醉后CR拍片檢查。動

7、物模型建立4周后，在進(jìn)行第一次注射藥物和手法干預(yù)前，每組隨機(jī)選取3只動物，給予10％水合氯醛腹腔注射麻醉，拍攝腰椎X線正側(cè)位片。造模達(dá)8周，以過量10％水合氯醛腹腔注射麻醉將其處死，迅速從腰椎后正中線切開皮膚，逐層分離腰椎兩旁的肌肉韌帶，直達(dá)椎體。取下整個腰椎段脊柱迅速放在冰面上，用眼科剪刀、鑷剝離椎間小關(guān)節(jié)和椎體前方的軟組織，分別從L1椎體下緣和L2椎體上緣分離上、下軟骨終板，取出L1/2椎間盤組織。用同樣的方法取出L2/3、L3/4

8、、L4/5、L5/6椎間盤組織。將取出的大鼠L2/3～L5/6椎間盤組織，迅速放入事先預(yù)冷并編好號的取材盒中，置于液氮中保存。采用熒光定量PCR法檢測MMPs抑制劑和手法治療后相關(guān)基因COL-2a1， COL-1a1，Aggregcan，CILP，TGF—β1，VDR，MMP-3，MMP-13，Timp-3，Timp-1在大鼠腰椎間盤組織退變中的表達(dá)量，運(yùn)用DPS9.5版統(tǒng)計軟件包進(jìn)行方差分析和大鼠腰椎X光正位片側(cè)偏角度和相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)

9、度系數(shù)分析。 結(jié)論： (1)中醫(yī)手法和四環(huán)素相似的抑制COL-1a基因表達(dá)可知兩種治療方法都可延緩大鼠腰椎間盤的退變，具有相同作用，而對照組COL-1a的高表達(dá)更能說明這一點(diǎn)，并且與文獻(xiàn)關(guān)于椎間盤出現(xiàn)退變時Ⅰ型膠原增加相符。 (2)中醫(yī)手法和四環(huán)素能使COL-2a基因表達(dá)量增加，而其增加可延緩大鼠腰椎間盤的退變，這與對照組COL-2a型膠原基因的低表達(dá)應(yīng)證。 (3)中醫(yī)手法增加Aggrecan的表達(dá)量比四

10、環(huán)素更明顯，可見中醫(yī)手法對延緩大鼠腰椎間盤的退變的治療效果比四環(huán)素更明顯。 (4)CILP的表達(dá)量正常組最低，其它各組間的表達(dá)量相近，說明此動物模型造模相當(dāng)成功(椎間盤退變時CILP的含量高于正常水平)，從中醫(yī)手法可使TGF—β1的表達(dá)量增加可間接推知中醫(yī)手法可抑制CILP的表達(dá)，進(jìn)而延緩椎間盤退變。四環(huán)素也有類似效果。 (5)中醫(yī)手法可使TGF—β1的表達(dá)量增加，而其在椎間盤內(nèi)增多能促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，維護(hù)椎

11、間盤內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定可延緩大鼠腰椎間盤的退變，四環(huán)素?zé)o此作用。 (6)中醫(yī)手法使VDR的表達(dá)量較四環(huán)素高，而VDR的表達(dá)可以直接參與軟骨細(xì)胞的分化、增殖和成熟。而椎間盤中富含軟骨細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)中富含Aggrecan，因此中醫(yī)手法升高VDR的表達(dá)量而通過軟骨細(xì)胞增殖來延緩大鼠腰椎間盤的退變，減少了椎骨骨刺和椎間隙狹窄的可能性，這與影象學(xué)結(jié)果相一致。 (7)從MMP-3與TIMP-1的表達(dá)量可知，四環(huán)素可使MMP-3的表達(dá)量減少而

12、使TIMP-1的表達(dá)量增高，這種平衡可以延緩椎間盤的退變；中醫(yī)手法也可減少M(fèi)MP-3的表達(dá)量，并且在1％極顯著水平表達(dá)量與四環(huán)素相同說明中醫(yī)手法和四環(huán)素治療效果相同，都可以抑制MMP-3的表達(dá)而使TIMP-1的表達(dá)量增高，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解延緩椎間盤的退變。 (8)四環(huán)素因其負(fù)反饋?zhàn)饔每蓽p少TIMP-3的表達(dá)量，則MMP-13的表達(dá)量升高；而中醫(yī)手法可使TIMP-3的表達(dá)量升高并與正常組接近，則MMP-13的表達(dá)量降低，這