G-CSFR在心肌梗死后表達變化及G-CSF干預大鼠亞急性期心肌梗死的實驗研究.pdf

1、近期的研究表明，G-CSF對心肌缺血再灌注損傷有一定的心肌保護作用，G-CSF的作用可能由兩條途徑介導：一是心肌細胞膜上的G-CSFR；二是增加動員骨髓干細胞。G-CSF對亞急性期心肌梗死的干預作用及其機制目前尚無報道。本研究通過探索心肌梗死后大鼠心肌組織G-CSF的表達變化與G-CSFR分布及量的變化，以期尋找在心肌梗死亞急性期進行G-CSF干預的依據(jù)。 第一部分G-CSF及G-CSFR在大鼠急性心肌梗死后的表達變化

2、方法：結(jié)扎Sprague-Dawley大鼠冠脈前降支，構建心肌梗死模型，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription PCR，RT-PCR)檢測梗死心肌G-CSF在不同時間點(Oh，6h，12h，1d，3d和7d)的mRNA表達變化。同時，采用免疫組織化學技術了解G-CSFR在梗死后心肌組織的定位，并通過免疫印記法檢測G-CSFR在不同時間點(1d，3d，5d和7d)的蛋白表達變化規(guī)律。 結(jié)果：心肌梗死后

3、6小時，G-CSF在梗死區(qū)域心肌組織內(nèi)的表達開始增加，在梗死后12小時達峰值，1天后逐漸下降至正常水平。免疫組化檢測結(jié)果顯示G-CSFR在心肌梗死后1天僅定位于非梗死區(qū)域，3天后則逐漸在梗死區(qū)域出現(xiàn)陽性染色。免疫印記結(jié)果顯示，隨梗死時間延長在梗死區(qū)域G-CSFR表達增加，并在梗死后第5天達峰值。 結(jié)論：G-CSF在梗死后心肌組織表達增加，梗死區(qū)域可能通過損傷局部G-CSF的表達變化與骨髓形成信息交流。G-CSFR的表達變化較G-

4、CSF稍滯后，心肌梗死后G-CSFR在梗死區(qū)域呈現(xiàn)的表達變化規(guī)律，為在心肌梗死亞急性期進行G-CSF干預提供了依據(jù)。 心肌梗死后，經(jīng)過心肌壞死，炎性細胞侵入，肉芽組織階段，最終形成纖維瘢痕。肉芽組織中心肌成纖維母細胞(cardiacmyofibroblasts，CMF)的凋亡在心肌梗死的修復進程中起著關鍵作用。在第一部分的研究中發(fā)現(xiàn)G-CSFR在梗死組織表達增加，本部分將通過體外培養(yǎng)心肌成纖維細胞(cardiac fibrobl

5、asts，CF)及CMF，觀察CF及CMF是否存在G-CSFR的表達，并了解G-CSF對它們遷移與凋亡的影響；構建大鼠心梗模型，觀察肉芽組織的演變過程，間質(zhì)細胞衍生因子(stromal-cell-deftved factor，SDF-1)與CMF的定位關系；進一步通過體外實驗，觀察G-CSF對CMF中SDF-1表達的影響。 第二部分G-CSF對CMF凋亡、SDF-1表達及CF遷移的影響 方法：建立大鼠心肌梗死模型，通過免

6、疫組化方法觀察梗死區(qū)不同時間點α-SMA陽性表達情況。通過免疫雙熒光方法觀察α-SMA與SDF-1在心肌梗死后的表達定位。進行CF及心梗后肉芽組織內(nèi)CMF的體外培養(yǎng)，用RT-PCR．及免疫細胞化學法檢測有無G-CSFR的表達，并觀察G-CSF對CF細胞遷移、CMF凋亡和SDF-1表達的影響。 結(jié)果：心肌梗死后α-SMA陽性表達逐漸增多，至7d達高峰。免疫雙熒光提示α-SMA<'+>與SDF-1<'+>共定位于CMF細胞。體外培養(yǎng)

7、發(fā)現(xiàn)，CF及CMF細胞均存在G-CSFR表達。此外，G-CSF能有效抑制H<,2>O<,2>誘導的CMF細胞凋亡，增加CMF中SDF-1表達，并增加CF的遷移能力。 結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)G-CSFR在CMF細胞表達；G-CSF減少CMF的凋亡，增加CMF中SDF-1的表達，并增加CF的遷移能力；G-CSF可能通過上述作用改善亞急性期心肌梗死的心室重構。 在前面的研究中發(fā)現(xiàn)，G-CSFR在梗死區(qū)域表達增加，在體外，G-CSF能明

8、顯抑制CMF凋亡，促進CF遷移，增加CMF分泌SDF-1。本部分我們將在體情況下研究G-CSF干預亞急性期心肌梗死的作用，并進一步探討G-CSF對亞急性期心肌梗死的潛在作用機制。 第三部分G-CSF干預大鼠亞急性期心肌梗死的實驗研究 方法：建立大鼠心肌梗死模型，隨機分為干預組(T)和對照組(C)，分別在梗死后3天經(jīng)腹腔注射G-CSF(25 μg/kg/d)或等量生理鹽水，連續(xù)注射5天。分別在以下三個時間點處死大鼠進行相關

9、檢測：1、梗死后八天(Tn=4，Cn=4)，免疫印跡觀測SDF-1在兩組中梗死區(qū)域的表達變化；2、梗死后10天(Tn=5，Cn=5)，取心臟組織切片，行Tunel及Brdu免疫組織化學檢測，觀察兩組中梗死區(qū)域細胞凋亡及增殖情況，并用免疫印跡法檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達變化；3、梗死后4周(Tn=5，Cn=6)，分別觀察大鼠非梗死區(qū)域心肌細胞直徑，梗死區(qū)細胞α-SMA陽性率，細胞數(shù)量，膠原形成及梗死周邊的血管生成情況，以評價心室重構情

10、況。 結(jié)果：梗死后8天，G-CSF干預組梗死區(qū)SDF-1表達明顯高于對照組；梗死后2周，G-CSF干預組梗死區(qū)域細胞凋亡率明顯低于對照組，而細胞增殖及Bcl-2表達水平較對照組高；梗死后4周，干預組非梗死區(qū)心肌細胞直徑、膠原形成較對照組減少，而梗死區(qū)細胞數(shù)量，梗死周邊血管數(shù)量及α-SMA陽性區(qū)域較對照組增加。 結(jié)論： G-CSF干預亞急性期心梗可通過減少梗死區(qū)細胞凋亡，增加梗死周邊區(qū)域血管生成改善心肌梗死后心室重構，增加