大鼠坐骨神經(jīng)損傷后背神經(jīng)節(jié)microRNA的表達變化及其功能的初步研究.pdf

1、目的：研究大鼠坐骨神經(jīng)損傷后背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal rootganglion，DRG) microRNA(miRNA)的表達變化及其功能。
　　方法：選用健康成年雄性60-90日齡Spragu-Dawley(SD)大鼠，建立右側坐骨神經(jīng)切斷損傷模型，3天后分別提取損傷側和正常側（對照）與坐骨神經(jīng)相連的腰4-5(L4-5) DRG的總RNA，運用miRNA芯片技術篩選損傷后表達量出現(xiàn)差異的miRNA;進一步采用實時定量PCR(Qu

2、antitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和原位雜交方法對芯片差異表達miRNA進行驗證。運用生物信息學軟件，根據(jù)芯片及qRT-PCR結果對篩選的miRNA進行靶基因預測;根據(jù)預測結果，構建表達載體運用熒光素酶報告基因系統(tǒng)對候選miRNA的靶基因進行確認。最后，在培養(yǎng)的大鼠DRG感覺神經(jīng)元，轉(zhuǎn)染篩選獲得的目的miRNA，運用β-tubulinⅢ免疫熒光組織化學染色觀察其

3、對神經(jīng)元神經(jīng)突長度的影響、Western blotting觀察其對Robo2蛋白表達的影響研究其功能。
　　結果：MiRNA芯片結果顯示坐骨神經(jīng)切斷后，DRG內(nèi)有21種miRNA的表達出現(xiàn)下調(diào)。qRT-PCR及原位雜交結果均顯示miR-144、miR-145和miR-214的表達均下調(diào)，與芯片結果一致。生物信息學預測顯示Robo2和srGAP1的3'-非翻譯區(qū)(3'-untranslated regions，3'-UTR)存在mi

4、R-144、miR-145和miR-214的結合位點，熒光素酶報告基因系統(tǒng)結果顯示miR-145和miR-214能分別抑制Robo2和srGAP1的表達。Western blotting結果顯示培養(yǎng)的DRG感覺神經(jīng)元經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145后，Robo2的蛋白表達明顯下調(diào)，確認其是miR-145的靶基因，并且神經(jīng)突長度縮短，證實miR-145調(diào)控DRG感覺神經(jīng)元的神經(jīng)突生長。
　　結論：坐骨神經(jīng)損傷后DRG神經(jīng)元miRNA發(fā)生差異表達