KHSRP在坐骨神經(jīng)損傷后的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的:
　　研究KHSRP在坐骨神經(jīng)損傷后的表達(dá)情況，探究KHSRP與施萬細(xì)胞分化和神經(jīng)元軸突再生的關(guān)系，分析KHSRP與β-catenin的相互調(diào)節(jié)關(guān)系及兩者在施萬細(xì)胞分化和神經(jīng)元軸突再生過程中的作用，進(jìn)一步揭示KHSRP在周圍神經(jīng)損傷后的再生機(jī)制。
　　方法:
　　1.為了研究KHSRP在損傷后坐骨神經(jīng)中的表達(dá)，本研究通過構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型，利用western blot，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了KHSRP在正常

2、組織及損傷組織中的表達(dá)；采用免疫熒光方法檢測了KHSRP的細(xì)胞定位情況，分析其與施萬細(xì)胞分化和神經(jīng)元軸突再生的關(guān)系
　　2.為了研究KHSRP在施萬細(xì)胞分化過程中的作用，本研究通過構(gòu)建原代施萬細(xì)胞體外分化模型，western blot及RT-PCR技術(shù)檢測KHSRP、β-catenin及相關(guān)蛋白在此過程中的表達(dá)情況；通過核漿分離檢測KHSRP的胞漿轉(zhuǎn)移情況；通過構(gòu)建KHSRP小干擾RNA及β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒并結(jié)合免疫細(xì)胞

3、熒光技術(shù)檢測KHSRP是否通過調(diào)節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性從而介導(dǎo)施萬細(xì)胞的分化。
　　3.為了研究KHSRP在神經(jīng)元突起生長過程中的作用，采用100ng/ml NGF刺激未分化的PC12細(xì)胞，模擬神經(jīng)元體外分化過程，以及構(gòu)建原代DRG神經(jīng)元體外發(fā)育模型，檢測KHSRP在神經(jīng)元延伸過程中的表達(dá)、胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)及對神經(jīng)元突起延伸的影響。
　　4.原代施萬細(xì)胞和神經(jīng)元的共培養(yǎng)，模擬坐骨神經(jīng)損傷后施萬細(xì)胞的再成髓鞘化過程，檢測KHSR

4、P、β-catenin的表達(dá)及KHSRP的胞漿運(yùn)輸對β-catenin穩(wěn)定性的影響。
　　結(jié)果:
　　1. western blot及免疫組化分析顯示，KHSRP在坐骨神經(jīng)損傷后表達(dá)升高，在第5天達(dá)到最高，隨后逐漸回復(fù)。免疫熒光結(jié)果顯示KHSRP在NF200、S100及Oct-6陽性的細(xì)胞中均有表達(dá)，提示KHSRP可能在施萬細(xì)胞分化和神經(jīng)元軸突再生過程中發(fā)揮作用。
　　2.在cAMP誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞分化過程中，KHSRP

5、的表達(dá)升高，而β-catenin的表達(dá)降低。核漿分離結(jié)果顯示 KHSRP在分化過程中胞漿蛋白水平增加，相應(yīng)此時(shí)β-catenin的胞漿蛋白水平降低，提示KHSRP可能通過調(diào)節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性來介導(dǎo)施萬細(xì)胞的分化。KHSRP的小干擾RNA轉(zhuǎn)染施萬細(xì)胞后抑制了施萬細(xì)胞分化的形態(tài)發(fā)生，該效應(yīng)與過表達(dá)β-catenin的施萬細(xì)胞形態(tài)相似。
　　3. NGF刺激 PC12細(xì)胞分化和體外培養(yǎng)的原代 DRG神經(jīng)元發(fā)育的過程中，KHSR

6、P的蛋白及mRNA水平的表達(dá)均升高，而β-catenin成相反趨勢。此外也相應(yīng)觀察到KHSRP的胞漿聚集及β-catenin的胞漿穩(wěn)定性降低現(xiàn)象。KHSRP的小干擾RNA轉(zhuǎn)染的PC12或DRG神經(jīng)元突起延伸也受到影響。
　　4.施萬細(xì)胞和DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)過程中，KHSRP在1d表達(dá)最低，隨后隨著施萬細(xì)胞髓鞘化，表達(dá)逐漸增高，β-catenin的表達(dá)呈相反趨勢。核漿分離也顯示出KHSRP的胞漿轉(zhuǎn)移及β-catenin的穩(wěn)定性衰退現(xiàn)