豬EpCAM對細(xì)胞重編程和多能基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、豬既是重要經(jīng)濟(jì)動物，又是一種理想的醫(yī)學(xué)模型動物，獲得豬多能干細(xì)胞對動物育種和再生醫(yī)學(xué)研究有重要意義。但是，目前沒有豬ESCs建系的報(bào)道，已報(bào)道建系的（包括本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的）豬iPS細(xì)胞依然存在諸多問題。深入研究豬多能性相關(guān)基因，發(fā)掘豬與小鼠和人的信號通路差異，能夠?yàn)槲覀兝斫庳i多能干細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制提供幫助。國內(nèi)外已經(jīng)建系的豬iPSCs細(xì)胞中，EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)呈現(xiàn)高表達(dá)。

2、在人和小鼠中，EpCAM也可作為指示多能性的標(biāo)記物而用于iPS和其他多能細(xì)胞的鑒定和篩選。除了作為多能性標(biāo)記物外，EpCAM的胞內(nèi)水解產(chǎn)物EpICD可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)。
　　本研究以豬EpCAM基因和蛋白作為研究對象，通過檢測EpCAM在豬組織和已經(jīng)建系的豬iPS細(xì)胞中的表達(dá)情況，明確了EpCAM和豬多能性之間存在的聯(lián)系;通過在iPS細(xì)胞中敲低和超表達(dá)EpCAM，建立了EpCAM與豬多能基因的調(diào)控關(guān)系;通過在豬體細(xì)胞

3、向iPS誘導(dǎo)重編程過程中敲低或超表達(dá)EpCAM，發(fā)現(xiàn)了EpCAM及其裂解產(chǎn)物EpICD對細(xì)胞重編程過程起重要調(diào)控作用;最后，通過進(jìn)一步對EpCAM蛋白調(diào)控和信號通路的研究，明確了EpCAM在豬多能細(xì)胞中的作用方式和途徑。
　　1.EpCAM基因的轉(zhuǎn)錄譜及其表達(dá)調(diào)控
　　本研究通過檢測豬組織、iPS細(xì)胞、早期胚胎發(fā)育過程中和細(xì)胞重編程過程中EpCAM的表達(dá)變化，試圖建立EpCAM與豬多能性之間的聯(lián)系;通過構(gòu)建豬EpCAM啟動子

4、報(bào)告載體，嘗試了解豬EpCAM基因在iPS細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控情況。結(jié)果表明，豬各組織中均能檢測到EpCAM的表達(dá)，而在上皮細(xì)胞豐富的器官組織中，EpCAM表達(dá)量更高。在對建系的豬iPS細(xì)胞和豬成纖維細(xì)胞的比較中，EpCAM在各株iPS細(xì)胞中的表達(dá)水平均高于其前體細(xì)胞PEF，說明在重編程過程中EpCAM被激活;EpCAM的表達(dá)模式與關(guān)鍵的多能基因呈正相關(guān)，而與胚層分化基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān);EpCAM的表達(dá)還與MET的相關(guān)基因呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。對早

5、期胚胎中的多能基因表達(dá)分析結(jié)果則說明，EpCAM在豬早期胚胎中的表達(dá)模式與關(guān)鍵多能基因的表達(dá)模式類似。OCT4和SOX2蛋白對EpCAM啟動子具有下調(diào)作用，而KLF4、c-MYC、NANOG、LIN28、SALL4和ESRRB等多能轉(zhuǎn)錄因子對EpCAM啟動子具有上調(diào)作用。
　　2.EpCAM在細(xì)胞重編程過程中和iPS細(xì)胞中的調(diào)控作用
　　利用構(gòu)建的shRNA干擾載體和EpCAM超表達(dá)載體，觀察其對PEF細(xì)胞誘導(dǎo)重編程過程的影

6、響。敲低EpCAM表達(dá)會降低iPS誘導(dǎo)中的AP(alklin phosphatase，堿性磷酸酶)陽性克隆形成率，而超表達(dá)EpCAM則能夠顯著提高AP陽性率。在建系的豬DOX-iPS細(xì)胞中敲低EpCAM，導(dǎo)致內(nèi)源OCT4、SOX2、LIN28、SALL4和ESRRB的表達(dá)顯著下調(diào)，而超表達(dá)EpCAM則導(dǎo)致這些基因的顯著上調(diào)。另外，敲低內(nèi)源EpCAM的表達(dá)，DOX-iPS細(xì)胞克隆團(tuán)的形態(tài)會出現(xiàn)松散狀，表明EpCAM敲低導(dǎo)致的內(nèi)源多能基因下

7、調(diào)，進(jìn)而造成iPS細(xì)胞出現(xiàn)分化狀態(tài)。
　　3.豬EpCAM相關(guān)信號通路
　　本研究發(fā)現(xiàn)，豬EpCAM在細(xì)胞膜上經(jīng)蛋白酶水解，能夠產(chǎn)生一個(gè)胞內(nèi)多肽EpICD。通過利用小分子抑制劑抑制蛋白酶TACE和PS-2活性，可以降低EpCAM的裂解，減少EpICD的產(chǎn)生。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在豬不同組織細(xì)胞中TACE和PS-2的mRNA水平存在差異，表明在不同細(xì)胞中，EpCAM可能存在不同的裂解效率，從而產(chǎn)生不同豐度的EpICD來調(diào)

8、控其下游基因。通過在DOX-iPS細(xì)胞中添加TACE和PS-2的抑制劑，會使EpCAM靶基因OCT4，SOX2，LIN28和ESRRB等的表達(dá)量下調(diào)，說明EpCAM的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用是由其裂解產(chǎn)生的EpICD實(shí)現(xiàn)的。將超表達(dá)EpICD的載體轉(zhuǎn)染DOX-iPS細(xì)胞，可以顯著促進(jìn)iPS細(xì)胞中EpCAM下游靶基因的表達(dá)水平。在對PEF細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)重編程時(shí)，超表達(dá)EpICD可以提高形成克隆的AP陽性率。但是，在非iPS細(xì)胞培養(yǎng)條件下，在PEF中超表