Myostatin對豬肌衛(wèi)星細胞和脂肪來源干細胞成脂分化的調(diào)控機制研究.pdf

1、肌內(nèi)脂肪含量影響著豬肉的感官品質(zhì)性狀（多汁性、嫩度和風(fēng)味等），同時它也與人類的胰島素耐受性等疾病密切相關(guān)。存在于肌肉中的兩種干細胞群體（脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞）均具有分化為脂肪細胞的特性，但是肌內(nèi)脂肪細胞主要來源于哪種細胞并未得到證實。Myostatin(MSTN)是由肌細胞分泌的、對肌肉生長起負調(diào)控作用的分泌性蛋白，屬于TGF-β超家族。本課題組前期的研究結(jié)果表明，MSTN處理肌衛(wèi)星細胞后其脂肪分化潛能受到抑制，但是MSTN處理后

2、的脂肪來源干細胞分化潛能卻未受到抑制，由此推測:肌內(nèi)脂肪細胞可能主要來源于脂肪來源干細胞。但是，MSTN如何對這兩種細胞的成脂分化發(fā)揮不同的調(diào)控作用的機制仍是未知的，肌內(nèi)脂肪細胞主要來源于脂肪來源干細胞的推測也未得到證實。為了解決以上問題，本論文主要開展兩方面研究:首先用MSTN蛋白分別處理豬肌衛(wèi)星細胞和脂肪來源干細胞，比較肌肉生長發(fā)育關(guān)鍵基因成肌分化因子1（MyoD）和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)在MSTN

3、處理前后的表達情況;探討MyoD對PPARγ基因的調(diào)控作用。然后，豬肌衛(wèi)星細胞和脂肪來源干細胞經(jīng)MSTN處理48 h，利用高通量表達譜測序的方法篩選MSTN處理前后差異表達的基因，并對差異表達基因影響細胞成脂分化的作用進行研究。主要研究成果如下:
　　1.MSTN對PPARγ和MyoD基因表達量的影響
　　首先用酶消化法分離豬的脂肪來源干細胞(ADSCs)和肌衛(wèi)星細胞(MSCs)，然后分別通過免疫組化檢測desmin和CD4

4、4的表達情況及油紅O染色鑒定細胞的成脂分化能力對細胞進行鑒定，結(jié)果表示:成功分離了豬脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞。
　　脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞經(jīng)濃度為100 ng/mL MSTN分別處理0h、24 h、48 h，然后檢測PPARγ和MyoD在mRNA水平、蛋白水平及DNA甲基化水平上的表達情況。結(jié)果顯示:在脂肪來源干細胞中，MSTN處理24 h組與0h組相比，PPARγ和MyoD的表達量沒有顯著性變化，但是MyoD的表達量有上升

5、的趨勢;MSTN處理48 h組與0h組相比，PPARγ的mRNA水平顯著性上升了2.76倍，MyoD的mRNA水平顯著性上升了8.33倍;從0h至48 h，PPARγ和MyoD的蛋白表達量持續(xù)增加，而啟動子甲基化水平降低。在肌衛(wèi)星細胞中，MSTN處理0h至48 h的過程中，PPARγ和MyoD的mRNA水平持續(xù)下降;與0h相比，24 h和48 h時的PPARγ和MyoD的蛋白表達量減少，啟動子甲基化水平上升。
　　總之，在脂肪來源

6、干細胞中MSTN促進了PPARγ和MyoD的表達，并且與PPARγ相比，MyoD的表達量在mRNA水平上上升的時間較早(24h)且上升的程度較高(8.33＞2.76)。而在肌衛(wèi)星細胞中MSTN抑制了PPARγ和MyoD的表達。表明，在兩種細胞中MSTN對PPARγ和MyoD表達量的影響不同，進而影響了脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞的成脂分化。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子MyoD對PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　結(jié)果顯示:在脂肪來源干細胞中超

7、表達MyoD基因顯著性上調(diào)了PPARγ的表達，并且超表達組的脂滴沉積量及脂肪標(biāo)記基因(aP2和C/EBPα)的mRNA表達量都高于對照組，這表明超表達MyoD增強了細胞的成脂分化能力。而在肌衛(wèi)星細胞中干涉MyoD基因顯著性降低了PPARγ的表達，同時細胞的成脂分化能力受到抑制。
　　構(gòu)建5個PPARγ啟動子缺失片段，雙熒光素酶活性分析結(jié)果顯示pGL3-PPARγP3的活性最高。轉(zhuǎn)染MyoD超表達載體(pcDNA-MyoD)顯著提高

8、了缺失片段的熒光值。以野生型pGL3-PPARγP3質(zhì)粒為模板，將預(yù)測的MyoD結(jié)合位點和E-box位點突變后與pcDNA-MyoD共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒相比其熒光活性顯著性降低。EMSA和ChIP-PCR分別從體外、體內(nèi)證明了MyoD可以直接結(jié)合到PPARγ啟動子區(qū)。
　　3.MSTN處理豬ADSCs和MSCs后差異表達基因的篩選及功能分析
　　豬脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞的MSTN處理組及各自的對照組于48

9、h時利用Trizol法提取細胞的總RNA，每組3個生物學(xué)重復(fù)共構(gòu)建12個測序文庫用于高通量表達譜測序。其中規(guī)定AM為脂肪來源干細胞MSTN處理組;AC為脂肪來源干細胞對照組;MM為肌衛(wèi)星細胞MSTN處理組;MC為肌衛(wèi)星細胞對照組。測序結(jié)果顯示:AC與MC相比有257個差異表達基因（116個上調(diào)表達，141個下調(diào)表達）;AM與AC相比有139個差異表達基因（37個上調(diào)表達，102個下調(diào)表達）;AM與MM相比有741個差異表達基因(649個

10、上調(diào)表達，92個下調(diào)表達);MM與MC相比有1640個差異表達基因（60個上調(diào)表達，1580個下調(diào)表達）。
　　將AM/AC組差異表達基因及MM/MC組差異表達基因經(jīng)GO功能分析和KEGG通路分析，篩選與脂肪發(fā)育相關(guān)且在兩個對比組中有不同的表達模式的差異基因，本研究中選擇了兩個基因（WISP2和KLF6）做后續(xù)的研究。油紅O結(jié)果顯示:超表達WISP2抑制了脂肪來源干細胞的成脂分化，而干涉WISP2則促進了脂肪來源干細胞的成脂分化。

11、超表達KLF6促進了脂肪來源干細胞的成脂分化，而干涉KLF6則抑制了脂肪來源干細胞的成脂分化。
　　結(jié)論:①在脂肪來源干細胞中，MSTN促進MyoD的表達，然后MyoD作為轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到PPARγ的啟動子區(qū)域并且對其轉(zhuǎn)錄活性起到促進作用，PPARγ的表達進而觸發(fā)了細胞的成脂分化;而在肌衛(wèi)星細胞中，MSTN抑制MyoD的表達，MyoD對PPARγ的促進作用中斷，細胞的成脂分化也受到影響。②PPARγ和MyoD的表達受到啟動子甲基