窖蛋白的調(diào)控在肺動脈高壓治療中的作用.pdf

1、目的：
　　在本研究中建立肺動脈高壓模型，模型建立后采用靜脈注射F92A-Cav1基因修飾的BMSCs的方法，探索F92A-Cav1基因通過ERK信號通路促進肺動脈高壓新生血管形成的分子機制，并且探明F92A-Cav1基因修飾的BMSCs移植對肺動脈高壓的影響。
　　方法：
　　首先，采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建LV-Cav1與LV-F92A-Cav1慢病毒載體，構(gòu)建的慢病毒載體通過 PCR鑒定、測序鑒定、酶切鑒定，獲得插入

2、目的基因序列正確的慢病毒載體；采用Western blot觀察BMSC細胞中Cav蛋白的表達，陽性質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化、病毒包裝、病毒濃縮及純化獲得高滴度的慢病毒顆粒；其次，采用10mg/ml野百合堿建立肺動脈高壓大鼠模型，將Wistar大鼠隨機分為5組：即正常對照組、肺動脈高壓模型組、陰性對照組（LV-ZsGreen感染BMSCs細胞）、Cav1組（LV-Cav1病毒感染BMSCs細胞）、F92A-Cav1組（LV-F92A-Cav1病毒感染

3、BMSCs細胞）；將感染各種質(zhì)粒的1×108/ml的BMSCs于PAH模型建立2W后分別移植給各組大鼠，2w時間為一療程，治療2個療程，2個療程后觀察大鼠存活及一般情況；最后，于移植后4W處死大鼠，采用生理記錄儀記錄各組大鼠肺動脈壓力；H.E染色觀察肺小動脈壁結(jié)構(gòu)變化。免疫組化法測定MEK蛋白的表達；western blot觀察肺組織中VEGF、ERK蛋白的表達情況；Realtime-PCR檢測肺組織中Transgelin、ROCK m

4、RNA的表達。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)PCR鑒定、測序鑒定、酶切鑒定證明慢病毒載體構(gòu)建成功；Western blot證實轉(zhuǎn)導(dǎo)LV-Cav1與LV-F92A-Cav1慢病毒質(zhì)粒的BMSCs細胞Cav的表達增高；各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞的轉(zhuǎn)染效率達85％以上；與正常對照組相比，經(jīng)野百合堿注射的Wistar大鼠肺動脈壓力明顯增高，PAH大鼠模型構(gòu)建成功；負載不同慢病毒基因的BMSCs移植PAH大鼠后，與正常對照組相比，PAH大鼠生活一

5、般狀況較差，飲食量減少，死亡率明顯增高，肺動脈壓力增高，肺小動脈壁增厚，肺組織中MEK、Transgelin及ROCK表達增加（p<0.05，p<0.01），VEGF、ERK表達無明顯改變（p>0.05）。而與PAH組相比，F(xiàn)92A-Cav1組大鼠，一般狀況較好，飲食量增加，無大鼠死亡，肺動脈壓力降低，肺小動脈壁變薄，肺組織中MEK、ERK及VEGF表達顯著增加（p<0.05，p<0.01），Transgelin及ROCK表達明顯減少（

6、p<0.05，p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)PCR鑒定、測序鑒定、酶切鑒定及Western blot證明載體構(gòu)建成功；大鼠PAH模型構(gòu)建成功；移植F92A-Cav1基因修飾的BMSCs可以有效改善大鼠的一般狀況，降低肺動脈壓力，改善肺小動脈管壁增厚程度、減緩右心室肥厚的程度；F92A-Cav1基因可以增強VEGF的活性，進而激活MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路，活化內(nèi)皮細胞增殖，刺激新血管生成；F92A-Cav1基因還可以抑