乙型肝炎病毒感染與宿主淋巴細(xì)胞HLA-1類分子關(guān)系研究.pdf

1、檢測(cè)HBV感染后慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化及肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ類分子表達(dá)，建立檢測(cè)相應(yīng)患者淋巴細(xì)胞內(nèi)HLA-A mRNA方法；應(yīng)用人IL-2刺激患者淋巴細(xì)胞并進(jìn)行LDH釋放試驗(yàn)；探討慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ類抗原分子在宿主細(xì)胞免疫狀態(tài)中的作用，對(duì)患者細(xì)胞免疫功能紊亂機(jī)制提供新的思路。 方法： 1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞表面HLA-Ⅰ、Ⅱ類分

2、子： 淋巴細(xì)胞抗體的標(biāo)記：取四支試管，標(biāo)記為HLA-Ⅰ-Ctr、HLA-Ⅱ-Ctr、HL-A-I、HLA-Ⅱ；取同型對(duì)照液IgGl-FITC 10u1分別加入HLA-Ⅰ-Ctr、HLA-Ⅱ-Ctr管中，分別取10ulHLA-ABC-FITC、HLA-Ⅱ-FITC-加入HLA-I、HLA-Ⅱ管中；各管中加入100ul抗凝全血。以標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)整儀器，以HLA-Ctr管做陰性對(duì)照。在前散射和測(cè)散射Dotplot二維圖中，劃出淋巴細(xì)胞區(qū)，

3、收集10<'4>個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)淋巴細(xì)胞作FITC熒光強(qiáng)度檢測(cè)，熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)放大，光反射數(shù)據(jù)存軟盤(pán)，全部數(shù)據(jù)用CellQuest Plot軟件進(jìn)行單色熒光參數(shù)獲取及分析。 2、RT-PCR檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA含量：根據(jù)GenBank中公布的HLA-A基因序列，選取基因非多態(tài)區(qū)域外顯子4，5的部分堿基，設(shè)計(jì)表達(dá)HLA-A基因位點(diǎn)的上下游引物，分別標(biāo)記為p1，p2，外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的提取；提取的RNA與不

4、同的引物組合置于RT-PCR．反應(yīng)體系中擴(kuò)增，以539bp的β-actin作為內(nèi)參照，擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，篩選與預(yù)期片段相吻合的特異性引物。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以1.5％瓊脂糖凝膠，電壓120v，然后于凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描，電泳結(jié)果通過(guò)Bandscan軟件分析，計(jì)算相對(duì)灰度值。 3、LAK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定 無(wú)菌制備人外周血淋巴細(xì)胞；將收取的淋巴細(xì)胞用完全培養(yǎng)液稀釋至濃度為1×10<'8>個(gè)/L。在3

5、7℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)五天，于第二、四天添加完全培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。按CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒操作指南選擇最佳靶細(xì)胞數(shù)0.5×10<,8>/ml。用CM調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞一淋巴細(xì)胞的濃度，以效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞按20：l比例混合加入96孔板，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)四個(gè)副孔，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔，靶細(xì)胞最大釋放孔，培養(yǎng)液對(duì)照孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板移入CO<,2>恒

6、溫培養(yǎng)箱，在37℃，5％CO<,2>濃度和飽和濕度的條件下培養(yǎng)4h后，離心1000 rpm，4min，取上清50μl，用多孔加樣板轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，在每個(gè)孔中加入50 μl substract buffer,避光室溫30min后，每孔加入50μ1 stop solution,在酶聯(lián)檢測(cè)儀上，選擇492nm檢測(cè)波長(zhǎng)，645nm參考波長(zhǎng)，以培養(yǎng)液對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度A，計(jì)算LAK細(xì)胞活性。 結(jié)果： 1、外周血淋巴細(xì)

7、胞HLA-I類分子平均熒光強(qiáng)度在慢性乙型肝炎(335．80)、肝炎后肝硬化(309.78)、肝癌患者(114.04)與正常對(duì)照組(565.08)均有顯著性差異(p<0.01)，隨慢性乙肝、肝硬化、肝癌病情的加重外周血淋巴細(xì)胞HLA-I類抗原平均熒光強(qiáng)度逐步降低。外周血淋巴細(xì)胞HLA-I類分子表達(dá)率在慢性乙肝、肝硬化、肝癌患者分別為99.24[％]，97.84％、96.45％，與正常對(duì)照組(99.83％)無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

8、 2、HLA-II類分子表達(dá)率在慢性乙型肝炎為(38.28％)、肝炎后肝硬化(42.21％)、肝癌患者(52.75％)，其中肝硬化組和肝癌組與正常對(duì)照組(32.50％)有顯著性差異(p<0.01)；慢性乙型肝炎組和正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(p>0.05)。外周血淋巴細(xì)胞HLA．II類分子平均熒光強(qiáng)度在慢性乙肝、肝硬化、肝癌患者分別為66.0、77.36、88.96，與正常對(duì)照組(60.39)無(wú)顯著性差異(p>0.05)。 3、

9、HLA-A mRNA在慢性乙型肝炎，肝硬化，肝癌患者中表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(p<0.05)，而且隨慢性乙型肝炎，肝硬化，肝癌患者病情逐步加重HLA-A mRNA的含量下降。 4、慢乙肝組、肝硬化組和肝癌組患者淋巴細(xì)胞體外經(jīng)IL-2誘導(dǎo)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性下降，隨慢性乙肝、肝硬化、肝癌病情的加重外周血淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)殺傷活性有逐步降低趨勢(shì)。 結(jié)論： 1、在國(guó)內(nèi)率先進(jìn)行了慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血淋巴

10、細(xì)胞HLA-I、II類抗原分子的檢測(cè)，為進(jìn)一步研究淋巴細(xì)胞膜表面HLA-I類抗原分子的功能和作用奠定了基礎(chǔ)。 2、成功建立了檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)HLA-A mRNA的RT-PCR一步法，并首次應(yīng)用于慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者的研究，從基因轉(zhuǎn)錄水平上探討機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)與HLA-A的關(guān)系，隨病程進(jìn)展淋巴細(xì)胞內(nèi)HLA-AmRNA下降更為顯著，且有望成為反映細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一。 3、慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞