人PRL-3基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析及初步研究.pdf

1、大腸癌是一種常見、嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤。近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的改善，尤其是膳食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌的發(fā)病率與死亡率有逐年上升的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大腸癌患者死亡的主要原因。臨床上有一半以上的大腸癌患者在行根治性手術(shù)前已出現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移，它是大腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的直接原因。因此，闡明大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是大腸癌研究的重要內(nèi)容。 PRL-3是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的少數(shù)特異性表達(dá)分子之一。應(yīng)用基因表達(dá)系列分析技

2、術(shù)分析大腸癌肝轉(zhuǎn)移基因表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，PRL-3是在18例大腸癌肝轉(zhuǎn)移標(biāo)本中唯一持續(xù)高表達(dá)的基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，無論具體轉(zhuǎn)移的部位如何，大多數(shù)大腸癌的轉(zhuǎn)移標(biāo)本中PRL-3的轉(zhuǎn)錄水平均明顯增加；而該基因在正常大腸上皮或者非轉(zhuǎn)移性原發(fā)大腸癌中極少表達(dá)或不表達(dá)。不同的研究組已經(jīng)分別證實(shí)這一結(jié)果。因而，PRL-3成為大腸癌轉(zhuǎn)移研究中的“魅力”基因，可作為大腸癌轉(zhuǎn)移治療的重要靶點(diǎn)。 PRL-3又稱為PTP4A3，位于人類第八號(hào)染色體上(8q2

3、4.3)，從其基因組的結(jié)構(gòu)看，其鄰近區(qū)域存在如PTK2、GPR20及TSSK5P1等基因。PRL-3基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其5’端和3’端均存在非翻譯區(qū)域(UTR，untranslatedregions)，UTR的存在可能與PRL-3基因的調(diào)控有關(guān)。PRL-3與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系已明確。到目前為止，仍存在許多待闡明的重要問題。PRL-3參與的信號(hào)通路至今尚不清楚；作為一種磷酸酶，其底物至今尚不確定；尤其重要的是調(diào)控PRL-3基因

4、表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。闡明PRL-3基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制是闡明PRL-3在腫瘤轉(zhuǎn)移中作用的重要基礎(chǔ)。 研究方法： (1)運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析和預(yù)測(cè)PRL-3基因的啟動(dòng)子區(qū)域及其在該區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。從美國國立生物技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫(NCBI，http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/mapview)獲得人PRL-3基因及其上游5kb DNA序列。應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)PRL-3基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)Transcri

5、ptional RegulatoryElement Database(http：//mlai．cshl．edu/cgj-bin/TRED)，并獲取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游700bp與下游300bp的DNA片段。將獲得的DNA片段在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，確定相關(guān)DNA序列在基因組的位置及與PRL-3基因轉(zhuǎn)錄本的關(guān)系。對(duì)獲得的啟動(dòng)子區(qū)域DNA片段潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。 (2)將PRL-3基因啟動(dòng)子區(qū)域即PRL-3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-6

6、99 bp至299 bp區(qū)域及含有Snail結(jié)合位點(diǎn)核心寡核苷酸序列CACCTG的-642 bp至-383 bp區(qū)域克隆至具有熒光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basiei載體，然后轉(zhuǎn)染到人大腸癌細(xì)胞系SW480及SW620、人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2及人胚腎上皮細(xì)胞株293A細(xì)胞，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。 (3)運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)與PCR擴(kuò)增相結(jié)合及凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)確定PRL-3基因的啟動(dòng)子區(qū)域是否存在Snail的結(jié)合位點(diǎn)。

7、(4)為了進(jìn)一步研究Snail與大腸癌的關(guān)系，我們以大腸癌細(xì)胞株SW480、SW620為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分析Snail在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。同時(shí)以大腸癌組織及相應(yīng)癌旁粘膜、腺瘤為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析Snail在這些組織中的表達(dá)情況。 主要結(jié)果： (1)應(yīng)用TRED在線分析系統(tǒng)對(duì)人PRL-3基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，共獲得三種可能的啟動(dòng)子區(qū)域；與含PRL-3基因的基因組序列進(jìn)行比

8、對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)它們均位于PRL-3基因上游區(qū)域。一般認(rèn)為基因的啟動(dòng)子區(qū)域位于該基因上游約3-5kb的區(qū)域，特別是該基因上游1kb左右的區(qū)域。由于其中第3號(hào)啟動(dòng)子序列距離人PRL-3基因距離最近，位于該基因上游約1kb的DNA區(qū)域，與5’端非翻譯區(qū)域鄰接。為確定這一區(qū)域可能存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，進(jìn)一步我們應(yīng)用在線Consite分析系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、n-MYC、AdLNT、E74A、NF-kappaB、NRF-2及

9、AML-1等的結(jié)合位點(diǎn)。在該區(qū)域的-500bp至-451 bp之間存在Snail結(jié)合的核心寡核苷酸序列CACCTG，另外在其它多個(gè)區(qū)域存在類似這一核心序列的DNA序列。 (2)為證實(shí)這一區(qū)域具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子活性，以人大腸癌細(xì)胞株SW480、SW620，中國人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2，人胚腎上皮細(xì)胞株293A為研究對(duì)象，選取了較完整的序列(-699 bp～299 bp區(qū)域)以及其中含有Snail結(jié)合位點(diǎn)核心寡核苷酸序列CACC

10、TG的短片段(-642 bp～-383 bp)克隆到相關(guān)啟動(dòng)子活性檢測(cè)的熒光素酶報(bào)告基因載體，并進(jìn)行活性檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)它們?cè)谒姆N不同的細(xì)胞株中均具有啟動(dòng)子活性(P≤0.016)，其中含有Snail結(jié)合位點(diǎn)核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性強(qiáng)于較完整的序列(P≤0.012)。 (3)應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)結(jié)合PCR擴(kuò)增的方法對(duì)人大腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Snail可與人大腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞PRL-3基因啟

11、動(dòng)子區(qū)域的多個(gè)DNA片段結(jié)合，其中包括含有Snail結(jié)合位點(diǎn)核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段。運(yùn)用凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRL-3基因啟動(dòng)子區(qū)域具有Snail結(jié)合位點(diǎn)。 (4)Snail在人大腸癌細(xì)胞系SW480與SW620細(xì)胞均有較強(qiáng)的表達(dá)，并且定位在SW480與SW620細(xì)胞的細(xì)胞核里。SnMl在正常結(jié)直腸粘膜、腺瘤、結(jié)直腸癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)明顯不同，差異具有顯著性(X<'2>=92.852，P=0.000)

12、。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，腺瘤SnMl表達(dá)比正常結(jié)直腸黏膜組織強(qiáng)(z=-2.902，P=0.004)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織SnMI表達(dá)比結(jié)直腸癌組織強(qiáng)(Z=-4.951，P=0.000)，而結(jié)直腸癌組織SnMl表達(dá)比腺瘤組織強(qiáng)(Z=-3.572，P=0.000)。Snail表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)(Z=-2.043，P=0.041)，即Snail表達(dá)弱者轉(zhuǎn)移的發(fā)生率低，表達(dá)強(qiáng)者其轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。 結(jié)論： (1)PRL-3基因的啟動(dòng)子位