冠心病患者單核細(xì)胞CX3CR1表達(dá)的研究及辛伐他汀的干預(yù)作用.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronaryheartdisease，CAD)是一種多種因素共同作用而導(dǎo)致的心血管疾病，其病理機(jī)制至今尚未完全闡明。自從19世紀(jì)中葉Virchow學(xué)者提出慢性炎癥和纖維細(xì)胞增殖作為AS損傷病理機(jī)制的概念以來(lái)，愈來(lái)愈多的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，炎癥和免疫反應(yīng)可引起的血小板、白細(xì)胞翻附和聚集以及遷移以致于血管內(nèi)皮損傷，在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的形成中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。1999年Ross提

2、出“動(dòng)脈粥樣硬化是血細(xì)胞、紊亂血流和血管壁之間的動(dòng)態(tài)相互作用的結(jié)果，是一種高度特異性的細(xì)胞分子反應(yīng)為特征的炎癥進(jìn)程”。他將動(dòng)脈粥樣硬化定義為慢性炎癥過(guò)程得到大家的認(rèn)同。著名的“損傷-反應(yīng)”學(xué)說(shuō)中概括了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的過(guò)程：“內(nèi)皮功能低下→內(nèi)皮受損→特異分子釋放→單核細(xì)胞和T細(xì)胞粘附集聚→遷移至內(nèi)膜下→巨噬細(xì)胞、吞噬脂質(zhì)→泡沫細(xì)胞、TC→脂斑→促凝作用→血管活性分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞介素→持續(xù)炎癥反應(yīng)→平滑肌細(xì)胞遷移和炎癥細(xì)胞交織→斑

3、塊形成→血管壁增厚(重構(gòu)代償性反應(yīng)機(jī)制)→大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集→斑塊增大→軟質(zhì)斑塊和壞死脂質(zhì)核由纖維帽覆蓋→成熟斑塊形成?！背墒彀邏K在炎性分子的作用下可破裂和出血、血栓形成，即心臟急性事件發(fā)生的病理機(jī)制。由此可見(jiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞在危險(xiǎn)因素作用下出現(xiàn)功能改變而表達(dá)多種炎癥趨化物，誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附及浸潤(rùn)內(nèi)皮，單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中起著中心環(huán)節(jié)作用。 而在上述病理過(guò)程中，有一些趨化因子能夠促使上述反應(yīng)發(fā)生，所以這些趨化因子被認(rèn)

4、為是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一。那么，趨化因子在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過(guò)程中到底起什么作用呢?首先，在A(yíng)S的形成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子之間相互作用，從而使這些炎癥細(xì)胞穿過(guò)內(nèi)皮進(jìn)入受損的血管壁；之后，在趨化因子的作用下單核一巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞進(jìn)一步活化、增殖并在損傷局部聚集；動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的某些物質(zhì)，如氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)可能具有抗原性，在局部引起單核-巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

5、因此，炎癥細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化這一慢性炎癥反應(yīng)中功能的發(fā)揮依賴(lài)于多種趨化因子。 炎癥內(nèi)皮釋放一種新的趨化因子FKN(Fraetalkine)能與其受體CX3CR1結(jié)合，CX3CR1是新發(fā)現(xiàn)的CX3C趨化因子fractalkine的特殊受體，是跨膜結(jié)構(gòu)域受體，它介導(dǎo)健康細(xì)胞黏附到fractalkine并不需要G蛋白激活，而且以不依賴(lài)選擇素和整合素的方式捕獲或吸引白細(xì)胞緊密黏附。趨化因子FKN與其受體CX3CR1結(jié)合引發(fā)Gi蛋白偶聯(lián)的

6、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并以劑量依賴(lài)的方式增強(qiáng)表達(dá)該受體自然殺傷細(xì)胞(NK)的殺傷力，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損失，而且還可以是表達(dá)CX3CR1的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生方向性遷移信號(hào)，向血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、黏附，并有效跨越血管向血管內(nèi)皮下特定部位遷移，最終促使動(dòng)脈粥樣硬化的形成。由此可見(jiàn)，任何影響CX3CR1表達(dá)水平的因素都有可能影響白細(xì)胞的流動(dòng)并導(dǎo)致相應(yīng)的疾病如冠心病。因此，通過(guò)對(duì)外周血單核細(xì)胞上CX3CR1表達(dá)水平的研究可能有助于早期診斷動(dòng)脈粥樣硬化性心

7、臟病，并且對(duì)其嚴(yán)重程度及預(yù)后做出一定的評(píng)估。 他汀類(lèi)藥物是目前臨床上有效的降血脂藥物之一，近年來(lái)大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，該類(lèi)藥物除具有顯著的降血脂作用外，還有其他抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。它作為心腦血管病一級(jí)或二級(jí)預(yù)防治療，都明顯降低心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率，改善冠心病患者介入治療的預(yù)后。研究表明，他汀類(lèi)藥物在動(dòng)脈粥樣硬化形成的各個(gè)環(huán)節(jié)均發(fā)揮作用。1)改善內(nèi)皮功能。他汀類(lèi)藥物通過(guò)上調(diào)舒血管物質(zhì)，增強(qiáng)內(nèi)皮對(duì)舒血管物質(zhì)敏感性以及減少

8、上調(diào)內(nèi)皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)的表達(dá)，增加eNOSmRNA的穩(wěn)定性，減少ox-LDL對(duì)eNOS的負(fù)向調(diào)節(jié)。2)抑制炎癥。他汀類(lèi)藥物通過(guò)降低細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、炎癥相關(guān)因子和蛋白分子的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)。而FKN-CX3CR1系統(tǒng)具有趨化和黏附的功能，他汀類(lèi)藥物是否通過(guò)抑制該通路來(lái)抑制炎癥反應(yīng)成為本研究的一個(gè)內(nèi)容。3)抑制平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡。4)穩(wěn)定斑塊的作用。他汀類(lèi)藥物能減少脂質(zhì)沉積，減少泡沫細(xì)胞的

9、形成，起到穩(wěn)定斑塊的作用。5)抑制血栓形成。他汀類(lèi)藥物從抑制血小板活性、減少血小板聚集、提高血液纖溶活性和抑制凝血等途徑抑制血小板形成。 為了進(jìn)一步研究動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)具有黏附和趨化作用的FKN的獨(dú)特受體CX3CR1在冠心病患者外周血單核細(xì)胞的表達(dá)情況，來(lái)進(jìn)一步闡述冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊的形成與炎癥有關(guān)。同時(shí)，又分別通過(guò)細(xì)胞及臨床實(shí)驗(yàn)研究他汀類(lèi)藥物-辛伐他汀除降脂外的其他作用。 本實(shí)驗(yàn)分為三

10、個(gè)部分。首先，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)CX3CR1在冠心病患者外周血單核細(xì)胞上的表達(dá)。接著，采用體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainraction，RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblotting)等方法，研究辛伐他汀對(duì)CX3CR1表達(dá)的影響及其與健康人的差異。最后通過(guò)臨床對(duì)冠心病患者應(yīng)用辛伐他汀

11、藥物，探討辛伐他汀對(duì)CX3CR1表達(dá)的影響。結(jié)果分述如下： 一、CX3CR1冠心病患者單核細(xì)胞上的表達(dá)： 分別入選臨床上冠脈造影正常的對(duì)照組、具有胸痛癥狀而造影正常的不明原因胸痛組、穩(wěn)定性心絞痛組和急性冠脈綜合癥組，共120例患者。提取所有患者外周血單核細(xì)胞后，用PE標(biāo)記的CX3CR1抗體標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CX3CR1的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冠心病患者CX3CR1表達(dá)水平高于正常對(duì)照組[正常對(duì)照組為(0.46

12、±0.272)％、穩(wěn)定性心絞痛組為(12.59±6.049)、急性冠脈綜合癥為(38.77±13.225)]；且急性冠脈綜合征患者CX3CR1表達(dá)高于穩(wěn)定型心絞痛患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且冠心病患者CX3CR1表達(dá)水平與Gensini積分呈顯著正相關(guān)(r=0.913，P<0.01)。這些說(shuō)明，患者CX3CR1表達(dá)水平越高，冠狀動(dòng)脈病變程度越嚴(yán)重，并且與Gensini積分呈顯著正相關(guān)性。 二、辛伐他汀對(duì)急性冠脈綜合

13、癥患者單核細(xì)胞CX3CR1表達(dá)的影響： 選取經(jīng)過(guò)冠脈造影確診為急性冠脈綜合癥的住院患者作為研究對(duì)象試驗(yàn)組，共63例。所有研究對(duì)象檢查前4周無(wú)感染外傷史。提取所有患者外周血單核細(xì)胞后，分為3個(gè)組：(1)對(duì)照組；(2)Sim組：分別加入10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/LSim；(3)10-5mol/LSim作用不同時(shí)間組：分別作用4、8、12h。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1)辛伐他汀濃度越高CX3CR1的表達(dá)量就越少，

14、各濃度組之間的相對(duì)熒光量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.439,P=0.000)。2)經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，在“對(duì)照”、“4h”、“8h”、“12h”4種不同作用時(shí)間下，相對(duì)熒光量相對(duì)熒光量有差異(F=83.274，P=0.000)。各組間兩兩比較，除“4h”和“8h”之間相對(duì)熒光量無(wú)顯著性差異外(P=0.280)，其他各作用時(shí)間組間差異均有顯著性意義(P<0.01)。說(shuō)明辛伐他汀可以降低CX3CR1的表達(dá)，并且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

15、三、臨床應(yīng)用辛伐他汀對(duì)冠心病患者CX3CR1表達(dá)影響的研究： 選擇因心前區(qū)疼痛入院后經(jīng)過(guò)冠脈造影確診為冠心病6個(gè)月后復(fù)查的患者作為研究對(duì)象試驗(yàn)組，共80例。此前已經(jīng)規(guī)律的臨床服用辛伐他汀6個(gè)月，將其用藥前后的血脂及CX3CR1表達(dá)情況做對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1)冠心病患者經(jīng)過(guò)6個(gè)月的辛伐他汀臨床治療，血脂各項(xiàng)指標(biāo)治療前后均有變化；TC治療前后t=26.988，P=0.000；TG治療前后t=13.163，P=0.000；HDL-C

16、治療前后t=-16.591，P=0.000；LDL-C治療前后t=19.051，P=0.000；差異有顯著意義，可認(rèn)為服用辛伐他汀后對(duì)冠心病患者血脂水平有改善。2)辛伐他汀對(duì)CX3CR1的表達(dá)有影響，可降低其表達(dá)，治療后CX3CR1的相對(duì)拷貝數(shù)與治療前比較有顯著差異(t=-8.437，P=0.000)?；颊叩难矫黠@改善，CX3CR1的表達(dá)也減少；說(shuō)明辛伐他汀可以抑制CX3CR1的表達(dá)。 通過(guò)上述三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，我們能夠得出

17、以下結(jié)論：1)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)炎癥損傷的過(guò)程。2)CX3CR1是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成、發(fā)展的相關(guān)因子，CX3CR1表達(dá)水平越高，冠狀動(dòng)脈病變程度越嚴(yán)重。3)細(xì)胞和臨床實(shí)驗(yàn)證明辛伐他汀除降脂作用外，還有抗炎作用；它可以降低CX3CR1的表達(dá)，并且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。 綜上所述，CX3CR1表達(dá)水平可作為反映冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度和數(shù)量的指標(biāo)，用以評(píng)估冠狀動(dòng)脈的病變情況。辛伐他汀可降低CX3CR1的表達(dá)，從而減慢炎癥細(xì)胞的遷移速