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文檔簡介
1、背景:人口老齡化已經(jīng)成為全球性公共衛(wèi)生問題。伴隨老年人口日益增多,老年腎臟病患者也隨之增多。腎臟是伴隨著衰老而出現(xiàn)明顯形態(tài)和功能改變的重要器官之一,老年人群是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)和急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)的高危人群。研究老年腎臟的衰老及急慢性腎損傷的發(fā)病機制,探討其在發(fā)生及發(fā)病過程中的關(guān)鍵因子,為臨床治療提供有用的線索,具有非常重要的意義。我們的前期研究
2、發(fā)現(xiàn),機體內(nèi)環(huán)境對腎臟器官衰老進程有著重要的影響,證實內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的改變可以逆轉(zhuǎn)或加速腎臟衰老進程。
目的:本研究在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上提出原創(chuàng)性的科學(xué)假說:衰老機體內(nèi)環(huán)境中可能存在某些促進/抑制器官衰老的體液因子,通過影響自噬、凋亡和炎癥因子的基因調(diào)控,促進器官衰老或使衰老器官變年輕。我們主要采用連體動物模型及與腎臟缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)模型的組合來探討內(nèi)環(huán)境對
3、腎臟衰老及老年腎臟缺血/再灌注損傷的作用研究。
方法:取3月齡和20月齡雄性C57 BL/6小鼠,建立小鼠連體動物模型并在連體后第1周及第2周主要采用小動物活體成像驗證模型成功與否;研究內(nèi)環(huán)境對腎臟衰老的具體分組:(1)青年小鼠單個對照組6只,(2)青年-青年同齡小鼠連體7對,(3)青年-老年異齡小鼠連體3對,(4)老年-老年同齡小鼠連體4對,(5)老年小鼠單個對照組6只;連體術(shù)后飼養(yǎng)5周采血、留取腎臟組織,進行衰老指標(biāo)p16
4、、SA-β-gal,凋亡指標(biāo)cleaved caspase-3,自噬指標(biāo)LC3、p62、多聚泛素聚集體的western blot檢測,觀察內(nèi)環(huán)境對腎臟衰老的影響;研究內(nèi)環(huán)境對老年腎臟急性腎損傷的實驗分7組(具體包含10個亞組):(1)青年小鼠假手術(shù)組(Y:SO),(2)青年小鼠雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型組(Y:IRI),(3)青年小鼠--年小鼠連體受體小鼠雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型組(Y-Y:IRI),(4)青年小鼠--年小鼠連體受體小
5、鼠雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型組(Y-O:IRI),(5)老年小鼠-老年小鼠連體受體小鼠雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型組(O-O:IRI),(6)老年小鼠雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型組(O:IRI),(7)老年小鼠假手術(shù)組(O:SO); IRI是在連體術(shù)后3周進行的,雙側(cè)腎臟缺血30分鐘后再灌注24h時采血檢測血清肌酐、尿素氮值,留取腎臟組織后行PAS及TUNEL染色觀察腎組織病理變化及腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況,并采用雙盲評分法對腎臟的病理損傷程
6、度打分及對TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù);利用細(xì)胞因子芯片QAM-CAA-2000分析以上各亞組中3-5只小鼠的血清,篩選出各組間有顯著差異的細(xì)胞因子,運用聚類分析找出可能影響腎臟衰老及老年急性腎損傷的細(xì)胞因子。采用短期熱量限制對老年大鼠進行飲食干預(yù)后,來探究腎臟衰老的分子機制,其中自噬和氧化損傷是我們的研究側(cè)重點。
結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了連體小鼠動物模型,并應(yīng)用解剖觀察、小動物活體成像掃描以及綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進行了連體小鼠間血
7、液循環(huán)相通的驗證;為接下來的研究奠定了基礎(chǔ)。(2)異齡連體小鼠術(shù)后生存率顯著低于同齡連體小鼠。異齡連體中老年小鼠的腎臟形態(tài)及功能未發(fā)生顯著性變化,與同齡連體老年小鼠表現(xiàn)相近。異齡連體中老年小鼠腎臟的衰老相關(guān)性指標(biāo)p16和SA-β-gal均未有顯著性改善,但有改善趨勢。異齡連體中老年小鼠腎臟的凋亡標(biāo)志物cleaved caspase-3有所降低,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。異齡連體中老年小鼠腎臟的自噬水平有增高趨勢,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。運用高通量
8、篩選方法發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)系統(tǒng)中可能與衰老密切相關(guān)的細(xì)胞因子有6種,分別為IGFBP-2、Eotaxin-2、Fractalkine、CD27、LIX和SCF,衰老時,這6種細(xì)胞因子均升高;而異齡連體5周后,青年內(nèi)環(huán)境可使老年小鼠血清中這6種細(xì)胞因子水平降低。(3)本部分研究對老年大鼠應(yīng)用短期CR,發(fā)現(xiàn)對腎臟衰老標(biāo)志性蛋白有改善作用,提高腎臟細(xì)胞的自噬水平;同時發(fā)現(xiàn),短期CR能減少老年大鼠腎組織中線粒體氧化性損傷,從而提出自噬活性的高低可能是
9、決定腎臟衰老的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。(4)在連體動物模型基礎(chǔ)上建立腎臟IRI模型,分別構(gòu)建了青年小鼠假手術(shù)對照、青年小鼠IRI模型、青年-青年連體中受體青年小鼠IRI模型、青年-老年連體中老年小鼠IRI模型、老年-老年連體中受體老年小鼠IRI模型、老年小鼠IRI模型、以及老年小鼠假手術(shù)對照。首次發(fā)現(xiàn):與老年-老年連體中受體老年小鼠IRI模型比較,青年-老年連體中老年小鼠IRI模型的24h血清肌酐和血清尿素水平明顯降低,腎組織損傷程度減輕,腎小管上皮
10、細(xì)胞凋亡數(shù)少,提示青年內(nèi)環(huán)境能夠顯著減輕老年小鼠的急性缺血/再灌性腎損傷。而且,我們同樣采用了高通量篩選的方式,對上述研究對象的血清做了120種細(xì)胞因子的差異性篩選,最后得到7種細(xì)胞因子可能是內(nèi)環(huán)境與AKI損傷密切相關(guān)的,分別為IGFBP-2、Fractalkine、EGF、SDF-1 alpha、CXCL16、TNF RII和ACE。當(dāng)AKI發(fā)生時,異齡連體后的老年小鼠在IRI24h時血清中這7種細(xì)胞因子的變化同青年小鼠AKI時。
11、r> 結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了連體小鼠動物模型,并應(yīng)用解剖觀察、小動物活體成像掃描以及綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進行了連體小鼠間血液循環(huán)相通的驗證。(2)完成了青年-青年、青年-老年和老年-老年連體動物模型的建立和術(shù)后的5周觀察,及在連體動物模型基礎(chǔ)上建立了腎臟IRI誘導(dǎo)的AKI模型。(3)發(fā)現(xiàn)異齡連體中老年小鼠腎臟的衰老指標(biāo)、凋亡水平、自噬水平均有改善趨勢。(4)發(fā)現(xiàn)異齡連體中老年小鼠IRI模型腎組織損傷程度較老年同齡連體模型中受體老年鼠
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