人ULBP3aa30~177蛋白的表達及單克隆抗體的制備.pdf

1、目的:
　　 表達和純化人ULBP3胞外段(aa30～177)融合蛋白,制備小鼠抗人ULBP3單克隆抗體,為進一步研究人ULBP3的生物學功能及臨床應用奠定實驗基礎。
　　 方法:
　　 1.人ULBP3胞外段(aa30～177)基因的克隆和原核表達:采用RT-PCR方法,從人結腸癌細胞株COLO205中獲得人ULBP3胞外段(aa15～177)基因,并克隆至pMD-18T載體,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,選擇陽性

2、克隆進行酶切鑒定和序列測定。從質(zhì)粒hULBP3胞外段(aa15～177)-pMD-18T中擴增hULBP3胞外段(aa30～177)核酸序列,連接至表達載體pQE30上。經(jīng)過測序鑒定,將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌M15,1mmol/LIPTG、30℃,4小時誘導目的蛋白表達;將表達的蛋白用Ni2+-IMAC柱進行純化、復性,并通過WesternBlot進行鑒定。
　　 2.單克隆抗體的制備:人ULBP3aa30～177融合蛋白免

3、疫BALB/c小鼠,應用雜交瘤技術,將免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合,并通過間接ELISA法篩選分泌小鼠抗人ULBP3抗體的雜交瘤細胞株,擴大培養(yǎng)并凍存。將成功分泌抗人ULBP3aa30-177蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞注射健康BALB/c小鼠腹腔內(nèi),兩周左右產(chǎn)生腹水。腹水經(jīng)ProteinG親和層析柱進一步純化后獲得腹水型抗體。
　　 3.單克隆抗體的鑒定:通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、Westernblot,流式細胞術和

4、對免疫組化染色對單克隆抗體進行鑒定。
　　 結果:
　　 1.成功克隆人ULBP3aa30～177基因,其編碼區(qū)為444bp,編碼148個氨基酸殘基,與GenBank中公布的序列(NM_024518.1)完全一致。成功構建了hULBP3aa30～177-PQE30原核表達載體,表達相對分子質(zhì)量約17kD的融合蛋白。該蛋白表達量高,復性后的hULBP3aa30～177蛋白濃度約為180pg/ml。經(jīng)免疫小鼠血清效價的測定,

5、證實該蛋白具有很強的免疫原性。WesternBlot結果顯示所制備抗體能與原核表達蛋白hULBP3aa30-177×6His特異性結合。
　　 2.間接ELISA法檢測其抗血清效價,其效價大于1:1.0×106。雜交瘤細胞融合率為50%,經(jīng)過間接ELISA法反復篩選,陽性率為16.7%,對其中2株雜交瘤細胞連續(xù)進行3次克隆化,獲得兩株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株B2-F1-F1和B4-C5-D11。兩株單克隆抗體識別不同的抗

6、原表位,其腹水效價分別為1:1.6×106(B2-F1-F1)和1:1.4×106(B4-C5-D11)。
　　 3.Westernblot結果顯示在27kD(細胞表達完整天然構象hULBP3蛋白的分子量)左右位置有目的條帶,間接證明結合的分子是hULBP3。流式細胞術分析顯示這兩株抗體分別能識別人結腸癌細胞株COLO205和結直腸癌原代細胞ULBP3分子。免疫組織化學染色結果顯示所制備的單克隆抗體也可識別結直腸癌組織標本細胞膜

7、上ULBP3分子。驗證了所制備的B2-F1-F1和B4-C5-D11單克隆抗體可識別細胞表面的ULBP3分子。
　　 結論:
　　 成功構建了原核表達載體pQE30-ULBP3aa30～177,并獲得高純度的人pQE30-ULBP3aa30～177融合蛋白;成功制備了小鼠抗人ULBP3分子的單克隆抗體。證實所制備的抗體不僅能識別人結腸癌細胞株COLO205,而且能特異地識別人臨床結直腸癌組織細胞膜表面的ULBP3分子。h