警報素IL-33介導(dǎo)狼瘡腎炎炎癥損傷的研究.pdf

1、目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種遺傳、性激素、環(huán)境、感染等多因素參與其中的特異性自身免疫性疾病，其特征性表現(xiàn)為全身多系統(tǒng)和臟器受累，血清中存在大量自身抗體。腎臟是SLE最容易受累的靶器官，狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE最重要的臨床表現(xiàn)之一。LN對患者預(yù)后影響極大，腎功能衰竭是SLE的三大主要死亡原因之一。目前LN的致病機制仍未完全清楚，治療仍以傳統(tǒng)抗

2、慢性風(fēng)濕病藥物（Diseases Modifying Antirheumatic Drugs,DMARDS）為主，生物制劑的出現(xiàn)雖然帶來了更多的治療選擇，但效果仍不盡人意。因此，針對LN疾病機制的深入研究以及新藥開發(fā)，依然任重道遠(yuǎn)。固有免疫系統(tǒng)異常在SLE發(fā)病早期即出現(xiàn)，甚至早于臨床表現(xiàn)，而且貫穿整個疾病過程。病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns， PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式

3、（damage associated molecularpatterns，DAMPs）是固有免疫系統(tǒng)識別外源性和內(nèi)源性危險信號的方式。他們可以被表達(dá)于免疫細(xì)胞上的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）所識別，從而啟動免疫應(yīng)答。警報素是機體組織細(xì)胞損傷時所釋放的內(nèi)源性危險分子。當(dāng)機體細(xì)胞壞死或免疫細(xì)胞受到炎癥刺激時，警報素通過被動或主動的方式釋放到細(xì)胞間質(zhì)中，與免疫細(xì)胞特異性受體結(jié)合，激活胞內(nèi)

4、信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，募集趨化單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和特異性T細(xì)胞，從而啟動固有免疫和調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)。在自身免疫性疾病中，由于自身免疫紊亂，警報素往往作為炎癥因子參與疾病的損傷過程，從而加重組織損傷并形成惡性循環(huán)。目前警報素在SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性硬化、干燥綜合征、炎癥性腸病等自身免疫性疾病疾病被廣泛研究。不同的警報素之間具有類似的免疫激活模式。白介素-33（interl

5、eukin-33,IL-33)是警報素的最新成員，其受體包括表達(dá)在免疫細(xì)胞表面的特異性受體ST2，以及被分泌到細(xì)胞外可以導(dǎo)致IL-33失活的誘騙受體可溶性ST2(Soluble ST2，sST2)。IL-33/ST2信號通路的激活，可激活受體細(xì)胞下游有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）及結(jié)合核因子κB（NF-κB），從而介導(dǎo)大量炎癥因子產(chǎn)生，造成自身免疫性組織受損。動物體內(nèi)實驗證明，予sST2治療可以減輕RA、藥物誘導(dǎo)急性腎損傷、哮喘等疾

6、病的炎癥受損。臨床研究發(fā)現(xiàn), SLE患者血清IL33/sST2顯著升高，而且升高水平與狼瘡疾病活動度指數(shù)評分（SLEDAI）呈正相關(guān)。SLE動物模型予以抗IL-33抗體治療可以減輕狼瘡腎炎病情。以上研究提示 IL-33/ST2通路可能以腎臟為靶點而參與SLE免疫激活，而拮抗該通路的激活有望成為治療LN的新途徑。但目前關(guān)于 IL-33/ST2通路如何參與狼瘡腎炎炎癥性損傷的機制仍不甚明了。本研究旨在闡明：IL-33是否來源于腎臟，儲備釋放

7、細(xì)胞是什么細(xì)胞，其表達(dá)水平是否可反應(yīng)腎臟受損程度；外周血表面表達(dá)ST2受體是什么免疫細(xì)胞，以及IL-33與表達(dá)ST2受體的免疫細(xì)胞是如何通過相互作用導(dǎo)致腎臟炎癥損傷等問題。
　　方法：⑴SPF級8周齡雌性MRL/lpr狼瘡小鼠以及同齡雌性C57BL/6J健康小鼠各5只，動態(tài)觀察2組小鼠一般情況以及檢測尿蛋白水平。18周齡時處死，檢測血清 ds-DNA、血清肌酐、尿素水平，行腎組織 HE、PASM、MASSON染色觀察腎臟病變。⑵R

8、eal time PCR方法檢查2組小鼠腎組織IL-33mRNA表達(dá)水平。western blot檢測腎組織IL-33蛋白表達(dá)水平。分析IL-33表達(dá)水平與尿蛋白、血清ds-DNA的相關(guān)性。⑶通過免疫組化技術(shù)，定位 IL-33在腎組織的表達(dá)位置，進(jìn)一步通過免疫熒光雙染定位IL-33的表達(dá)細(xì)胞來源。⑷流式細(xì)胞術(shù)檢測SLE患者及健康體檢者外周血CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞表面ST2受體的表達(dá)水平。使用軟件Image J進(jìn)行圖像分析，所

9、有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，正態(tài)分布并且方差齊同的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)分布資料以中位數(shù)表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗或秩和檢驗。等級資料組間比較采用秩和檢驗，相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)系數(shù)。p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：①2組動物在處死前均存活，C57組精神狀態(tài)良好，食欲良好，活躍，皮毛有光澤，未見脫毛，四肢關(guān)節(jié)無腫脹。MRL/lpr組精神狀態(tài)一般，食量較對照組減少，懶動,小鼠全身不同

10、程度浮腫。淺表處可觸及數(shù)量不等腫大淋巴結(jié)。皮毛顏色缺少光澤，但未見明顯脫毛。部分小鼠后膝關(guān)節(jié)輕度-中度腫脹。尿蛋白從14周齡開始檢測，每隔2周一次，MRL/lpr組所有小鼠均出現(xiàn)了不同程度的蛋白尿，但整體上沒有出現(xiàn)尿蛋白進(jìn)行性增多趨勢。C57組所有小鼠尿蛋白均為陰性。②MRL/lpr組血清BUN為10.04±1.79mmol/L，C57組為7.42±1.00 mmol/L，2組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.300）；MRL/lpr組血清

11、 Scr為25.60±7.30 ummol/L，C57組為25.75±8.54ummol/L，同樣2組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.878）。血清ds-DNA，MRL/lpr組均為陽性（2+～4+），而C57組則未見陽性表達(dá)，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.003）。③HE染色：C57小鼠腎組織可見腎小球結(jié)構(gòu)顯示清晰，小球內(nèi)可見血管袢；MRL/lpr狼瘡小鼠則見腎小球明顯肥大，結(jié)構(gòu)紊亂，小球及腎間質(zhì)可見大量淋巴細(xì)胞浸潤。PASM染色：

12、MRL/lpr狼瘡小鼠可見腎小球基底膜明顯增厚，內(nèi)皮及上皮細(xì)胞增生明顯；而C57小鼠基底膜基本正常，未見明顯內(nèi)皮及上皮細(xì)胞增生。MASSON染色：MRL/lpr狼瘡小鼠可見腎小球內(nèi)大量嗜紅免疫復(fù)合物沉積，腎小管內(nèi)可見大量蛋白管型；而C57小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見免疫復(fù)合物沉積，腎小管管腔未見蛋白管型。④MRL/lpr組較C57組表達(dá)IL-33 mRNA水平平均升高2.73±1.34倍，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.045）。說明從 mR

13、NA水平看，MRL/lpr小鼠腎組織上調(diào)了IL-33的表達(dá)。MRL/lpr組較C57組表達(dá)IL-33蛋白水平顯著升高（灰度比值為0.558±0.094 vs0.034±0.002），C57組IL-33表達(dá)量極少，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.0005）。說明從蛋白水平看，MRL/lpr小鼠腎組織上調(diào)了IL-33的表達(dá)。⑤spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示MRL/lpr小鼠腎組織IL-33灰度比值變化與半定量尿蛋白變化呈明顯正相關(guān)（r2=0

14、.72，p=0.037）。而與血清ds-DNA半定量水平則無明顯相關(guān)（r2=0.386，p=0.215），但也出現(xiàn)正相關(guān)趨勢。⑥MRL/lpr在腎小球基底膜區(qū)細(xì)胞有較多IL-33表達(dá)，腎間質(zhì)少見IL-33表達(dá)。C57只有極個別腎小球基底膜區(qū)細(xì)胞表達(dá)IL-33，較MRL/lpr顯著減少。進(jìn)一步行免疫熒光雙染檢測（IL-33+VWF）發(fā)現(xiàn)，IL-33表達(dá)在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞。⑦與健康對照組相比，ST2受體高表達(dá)于LN患者外周血CD4+T細(xì)胞及C