利用肺癌細胞特異性結(jié)合肽建立檢測肺癌的免疫酶法.pdf

1、肺癌的發(fā)病率和病死率居于全球惡性腫瘤中首位,且在不斷升高。我國的肺癌現(xiàn)狀更加嚴峻,由于發(fā)病率的快速攀升,肺癌在惡性腫瘤中已居于導致我國城市人口死亡的病癥之首。如果沒有相應措施來控制如吸煙和空氣污染這些肺癌的誘因,按現(xiàn)有數(shù)據(jù)推測,十年以后,我國每年將有100萬人口發(fā)生肺癌,成為肺癌患病人數(shù)最多的國家。肺癌患者在早期往往沒有明顯癥狀,去醫(yī)院就診時大多已處于晚期,發(fā)生了癌轉(zhuǎn)移,錯過了外科手術(shù)和放療的最佳時機,因此得不到根治,預后很差。因此,解

2、決肺癌危機的出路在于肺癌的早期診斷。
　　免疫酶染色法(Immunoenzymatic Assay,IEA)以酶標抗體催化底物顯色來反映抗原抗體的結(jié)合,廣泛應用于抗原定位、病原定性鑒定等。該方法從分子層面研究肺癌的基因和表觀遺傳學特征,有助于從本質(zhì)上認識腫瘤,從而實現(xiàn)早期診斷,顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)的基于腫瘤組織學類型和臨床表現(xiàn)的診斷方法的巨大應用潛力。傳統(tǒng)免疫酶法使用的是單克隆抗體或多克隆抗體,由于免疫動物這一過程必不可少,因此制備過程

3、復雜且耗時,成功率難以得到保障。本論文用噬菌體展示肽庫篩選肺癌細胞特異性結(jié)合肽來建立免疫酶染色法,具有技術(shù)難度低、制備周期短的突出優(yōu)勢。
　　噬菌體展示技術(shù)是通過基因工程手段將外源蛋白或肽段的基因克隆到噬菌體基因組DNA中,使其表達在噬菌體衣殼蛋白上,具有獨立的空間構(gòu)象。噬菌體展示技術(shù)結(jié)合了多肽的親和活性和噬菌體的可擴增性,并將展示肽的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi),實現(xiàn)了兩者間的連接和轉(zhuǎn)化,在通過“吸附-洗脫-擴增”的重復過程

4、篩選出與靶標特異性結(jié)合的噬菌體克隆后,通過測定基因序列可推斷展示在噬菌體表面的外源蛋白的氨基酸序列。噬菌體展示技術(shù)已被大量應用于腫瘤研究方面,如腫瘤抗原表位的篩選、腫瘤標志物的篩選以及腫瘤抗體的制備等,國內(nèi)外已有大量研究報道,為開發(fā)新的腫瘤診斷方法和靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　本課題以肺腺癌A549細胞為篩選靶標,人胚肺二倍體helf細胞做反相吸附細胞,從噬菌體隨機十二肽庫中篩選出與肺癌細胞特異性結(jié)合的噬菌體多肽,用其替代一抗,酶

5、標抗噬菌體抗體作二抗,建立檢測肺癌細胞的免疫酶染色法。4輪差減篩選后,從最后一輪的滴度檢測平板上,隨機挑取了分離良好的24個克隆進行ELISA鑒定,得到了9個對A549細胞具有高親和力的克隆,隨后對親和力最好的5號和10號噬菌體克隆進行細胞免疫化學鑒定,結(jié)果顯示5號噬菌體克隆的特異性優(yōu)于10號。因此用親和力和特異性最好的5號噬菌體克隆建立了檢測肺癌細胞的免疫酶法,并探討了最佳實驗條件,即5號噬菌體滴度5×109pfu/10μl,HRP/