新氨基糖苷類抗生素威替米星的藥效學(xué)研究及其對重組氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性.pdf

1、氨基糖苷類抗生素為我國臨床上治療嚴重感染的主要抗菌藥物之一，具有抗菌譜廣，抗菌活性強，水溶性好，無過敏反應(yīng)，價格低廉等特點。小諾霉素、奈替米星(乙基西索米星)、依替米星(愛大霉素)、丁胺卡那霉素(阿米卡星)和壯觀霉素(硫酸大觀霉素)等已成為我國臨床抗感染治療中不可缺少的藥物。威替米星為氨基糖苷類抗生素一類新藥，它是在橄欖星孢小單孢菌無錫亞種M-41發(fā)酵代謝產(chǎn)物之一威大霉素的基礎(chǔ)上1-N-乙基化得到的。 本論文第一部分研究了威替米

2、星的體內(nèi)外藥效學(xué)，包括對1185株臨床分離菌的MIC分布、MBC、KCs、MIC影響因素，以及對小鼠全身感染、小鼠泌尿道感染，兔皮膚燙傷感染的體內(nèi)療效。MIC試驗結(jié)果表明威替米星具有較強的廣譜抗菌活性，對大多數(shù)革蘭氏陰性菌的MIC<,50>值為0.25-1mg／L，對革蘭氏陽性菌MSSA和表葡菌的MIC<,50>分別為0.125和0.25mg／L，對MRSA和糞腸球菌的MIC<,50>均為4mg／L。威替米星對1185株臨床分離菌的總敏

3、感率為75.4％，與奈替米星(73.1％)相近，低于阿米卡星(82.2％)，高于威大霉素(65.4％)、慶大霉素(61.3％)、依替米星(64.9％)和妥布霉素(66.0％)。威替米星對慶大霉素耐藥菌株仍具有一定的抗菌活性，對405株慶大霉素耐藥臨床分離菌的敏感率為41.2％，低于阿米卡星(60.0％)，高于奈替米星(34.8％)、威大霉素(9.6％)、依替米星(18.0％)和妥布霉素(18.0％)。MBC和KCs試驗表明，威替米星對大

4、腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、金葡菌和表葡菌顯示殺菌作用，并且呈濃度依賴性特征。影響因素試驗表明低pH和二價金屬離子可降低威替米星的抗菌活性，而細菌接種量和血清蛋白結(jié)合對威替米星的抗菌活性無明顯影響。 威替米星皮下和靜脈給藥對大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌和金葡菌全身感染小鼠均具有較好療效，體內(nèi)抗菌活性與奈替米星相近，兩者無顯著性差異，P>0.05，對大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌和金葡菌感染小鼠的療效明顯優(yōu)于依替米星和

5、慶大霉素，P<0.01，對銅綠假單胞菌感染小鼠的ED5。值低于依替米星和慶大霉素，但無統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05。 威替米星對大腸埃希氏菌泌尿道上行性感染小鼠具有較好療效，給藥后各劑量組小鼠腎組織活菌落計數(shù)明顯低于對照組，腎剖面蓋印陰性率明顯高于對照組，P<0.01，抗菌活性優(yōu)于慶大霉素。 威替米星對兔皮膚燙傷并發(fā)大腸埃希菌感染具有較好療效，給藥后各劑量組皮膚組織活菌落計數(shù)明顯低于對照組，P＜0.05(低劑量組)或P＜0.

6、01(中、高劑量組)。威替米星中劑量組療效明顯優(yōu)于威大霉素和慶大霉素治療組，P＜0.01，稍優(yōu)于依替米星組和奈替米星組，但無顯著性差異，P＞0.05。細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要方式是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶，對藥物分子中保持抗菌活性所必須的基團進行修飾，使其與作用靶位核糖體的親和力大為降低。在革蘭氏陽性菌中最常見的修飾酶為氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6’)-APH(2")，該酶同時具有N端的乙?；D(zhuǎn)移酶活性和C端的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可

7、修飾幾乎所有種類的氨基糖苷類抗生素，使其與青霉素等作用于細胞壁的抗生素的協(xié)同作用消失。 本論文第二部分通過在大腸桿菌中重組表達氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6’)、APH(2”)和AAC(6t')-APH(2”)，制備酶提取物，構(gòu)建重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，研究了威替米星對氨基糖苷類雙功能修飾酶的乙?；D(zhuǎn)移酶活性和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的穩(wěn)定性，并且通過比較AAC(6’)-APH(2”)與AAC(6’)、APH(2”)對抗

8、生素修飾作用的差異初步研究了基因融合對酶修飾活性的影響。試驗中我們將糞腸球菌HH22的雙功能修飾酶基因重組克隆入蛋白表達載體pET-30a(+)，構(gòu)建了表達雙功能修飾酶的質(zhì)粒pET-30a-aac(6’)(含乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因，相應(yīng)的酶提取物為AAC(6’))，pET-30a-aph(2”)(含磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，相應(yīng)的酶提取物為APH(2”))和pET-30a-aac(6’)-aph(2”)(含雙功能修飾酶基因，相應(yīng)的酶提取物為AAC(6’

9、)-APH(2”))，然后將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主E coli BL2 1(DE3)，得到表達雙功能修飾酶的菌株，將這些菌株進行誘導(dǎo)培養(yǎng)、超聲破碎可以方便地制備酶提取物。用所得的酶提取物構(gòu)建了重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，用于評價氨基糖苷類抗生素對該修飾酶的穩(wěn)定性。此代謝模型中，我們將制備的酶提取物與氨?；擒疹惪股卦谝欢ǖ姆跤w系中進行乙酰化或磷酸化反應(yīng)(同時設(shè)不加第二底物的對照)，而后用高效液相檢測抗生素原型藥物峰的變化及

10、代謝產(chǎn)物峰的出現(xiàn)(與對照相比)來評價抗生素的雙功能修飾酶穩(wěn)定性。此方法簡便、快速、準確、自動化程度高，并可區(qū)分原型藥物峰和不同的代謝產(chǎn)物峰，為藥物的結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。缺點是缺乏判斷穩(wěn)定性的標準，需要同時進行兩個或兩個以上抗生素的檢測以評價抗生素的穩(wěn)定性差異。上述代謝模型我們分別評價了威替米星對AAC(6’)、AAC(6’)-APH(2”)乙?；D(zhuǎn)移酶活性，對APH(2”)、AAC(6’)-APH(2”)磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的穩(wěn)定性，并且與其半

11、合成前的母體化合物威大霉素和具有相似抗菌活性的奈替米星加以比較。結(jié)果顯示對于AAC(6')和AAC(6')-APH(2'')的乙?；D(zhuǎn)移酶活性，威替米星的穩(wěn)定性最高，被修飾百分率分別為27.02％和27.20％，低于奈替米星(98.64％和94.17％)和威大霉素(76.94％和59.17％)；對于APH(2'')和AAC(6')-APH(2'')的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，威替米星的穩(wěn)定性高于威大霉素，低于奈替米星。APH(2'')酶提取物C體

12、系時威替米星的被修飾百分率為49.60％，低于威大霉素(93.11％)，高于奈替米星(19.46％)；AAC(6')-APH(2'')酶提取物B體系時威替米星的被修飾百分率為49.99％，低于威大霉素(92.95％)，高于奈替米星(24.29％)。 氨基糖苷類雙功能修飾酶的一個顯著特征是其具有雙功能，N端為乙?；D(zhuǎn)移酶活性，C端為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，兩活性用常規(guī)的生化方法不能分開，并且該修飾酶的分子量約為單功能酶的2倍，因此推測是基

13、因融合的結(jié)果。該基因融合使細菌的耐藥譜擴大，幸免于大多數(shù)氨基糖苷類抗生素的作用。論文中比較AAC(6')-APH(2'')與AAC(6')酶提取物對抗生素的乙?；揎椬饔冒l(fā)現(xiàn)，與AAC(6')的檢測結(jié)果相比，AAC(6')-APH(2'')的檢測結(jié)果中威大霉素的兩個代謝產(chǎn)物峰分別出現(xiàn)了降低和升高的現(xiàn)象，而奈替米星和威替米星的代謝產(chǎn)物峰也分別出現(xiàn)了降低和升高的現(xiàn)象。說明兩個酶提取物的乙?；D(zhuǎn)移酶活性有差異，也就是說基因融合對乙?；D(zhuǎn)移酶活