家蠶中腸羧酸酯酶基因的克隆及槲皮素和有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、羧酸酯酶是一種廣泛分布于動(dòng)物、植物和細(xì)菌等生物的多功能酶系。由于序列的差異和底物的不同，COEs可分為八類：gliotactin，α-酯酶，乙酰膽堿酯酶，β-酯酶，神經(jīng)趨化蛋白，glutactin，保幼激素酯酶和神經(jīng)連接蛋白。研究表明，COEs在昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性和降解毒物的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。中腸做為昆蟲(chóng)代謝外源有毒物質(zhì)的主要場(chǎng)所，其內(nèi)有大量的解毒酶表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)家蠶中腸特異表達(dá)的COEs能被有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑顯著誘導(dǎo)，暗示它們?cè)谕庠从卸疚?/p>

2、質(zhì)的代謝中發(fā)揮重要作用。本文以家蠶大造品系為材料，選取家蠶幼蟲(chóng)中腸內(nèi)特異表達(dá)的α-家族羧酸酯酶基因Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27進(jìn)行了克隆和序列分析，同時(shí)研究了桑葉次生代謝物質(zhì)槲皮素和3種常用的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑（辛硫磷，毒死蜱和敵敵畏）對(duì)這4個(gè)基因表達(dá)的影響。另外，還測(cè)定了，OPs暴露后，家蠶中腸COE酶活性的變化。主要結(jié)果如下：
　　1.經(jīng)cDNA克隆，獲得家蠶羧酸酯酶Bmae2、Bmae17、Bmae18和B

3、mae27基因的完整編碼區(qū)序列長(zhǎng)度分別為1626bp、1629bp、1596bp和1680bp。
　　2.利用Signal IP4.0在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27分別含有一個(gè)20、20、17和14個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，暗示它們可能為分泌蛋白。與其它昆蟲(chóng)相關(guān)的多條COEs序列比較結(jié)果顯示，Bmae2和Bmae17保留羧酸酯酶活性必須的催化殘基 Ser、Glu和 His，也保持著α/β-酯酶家族的特征基

4、序Gly-x-Ser-x-Gly。但Bmae18和Bmae27的Ser殘基分別突變?yōu)锳sp和Gly殘基。因此，推測(cè)Bmae2和Bmae17可能仍保持著酯酶的水解活性。
　　3.表達(dá)譜檢測(cè)表明：Bmae2、Bmae17、Bmae18和 Bmae27均在家蠶中腸特異表達(dá)，暗示這4個(gè)基因可能在家蠶中腸對(duì)外源有毒物質(zhì)的代謝過(guò)程中起重要作用。
　　4.有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑暴露后家蠶中腸羧酸酯酶活性變化：用3種殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)處理的家蠶5齡第2天幼蟲(chóng)

5、，其中腸COEs活性有顯著地提高，毒死蜱、辛硫磷、敵敵畏的低/高濃度處理組誘導(dǎo)的最高酶活性分別是對(duì)照組的1.63/1.16、1.92/1.33、2.48/1.68倍。
　　5.槲皮素暴露下中腸特異表達(dá)羧酸酯酶基因表達(dá)的變化：Bmae2、Bmae17、Bmae18和Bmae27均能被槲皮素誘導(dǎo)，最大誘導(dǎo)倍數(shù)分別為6.90、2.21、1.30和8.78倍。
　　6.經(jīng)OPs處理家蠶后對(duì)克隆所得4個(gè)COEs基因表達(dá)量的變化：經(jīng)半定

6、量PCR和熒光定量PCR檢測(cè)，Bmae17和Bmae27在低濃度辛硫磷處理3天內(nèi)均上調(diào)表達(dá)，與酶活檢測(cè)結(jié)果基本一致，推測(cè)這2個(gè)基因可能主要參與對(duì)辛硫磷的解毒作用：敵敵畏處理組家蠶只有在處理第3天時(shí)中腸內(nèi)的Bmae17、Bmae18和Bmae27的表達(dá)量顯著上調(diào)，在處理的前兩天呈現(xiàn)出被抑制或與對(duì)照無(wú)顯著差異的現(xiàn)象，毒死蜱處理組也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，與酶活檢測(cè)結(jié)果不完全一致，推測(cè)中腸表達(dá)的其它COEs可能參與了這2種農(nóng)藥的解毒。
　　以上結(jié)