有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)用植物酯酶的研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用，由于多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥屬高毒、高殘留類(lèi)化合物，加上農(nóng)藥使用不合理，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重危害著消費(fèi)者的身體健康。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如氣相色譜法等，由于其處理過(guò)程的復(fù)雜性，檢測(cè)周期較長(zhǎng)等原因，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。因此，研究出方便、靈敏的快速檢測(cè)技術(shù)是控制農(nóng)藥殘留的重要手段之一。酶抑制檢測(cè)法具有檢測(cè)快速、設(shè)備和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合水果蔬菜的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)，受到基層機(jī)構(gòu)的普遍歡迎。酶抑制法根

2、據(jù)酶源的不同，分為動(dòng)物膽堿酯酶抑制法與植物酯酶抑制法兩種，其中動(dòng)物膽堿酯酶法由于酶源范圍窄、成本高，限制了其推廣應(yīng)用，而酶源豐富、廉價(jià)，取材方便的植物酯酶，近年來(lái)備受關(guān)注。
　　 本研究在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大植物酶源篩選范圍，選擇大白豆為有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶源，優(yōu)化了大白豆植物酯酶的提取工藝；研究了大白豆酯酶的純化方法；系統(tǒng)探討論了大白豆酯酶的特性；建立了有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法體系。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)通過(guò)對(duì)

3、大白豆、綠豆、黃豆、小麥仁、蕎麥仁、紅花蕓豆、黑蕓豆、白芝麻、橡石、薏仁米10種植物種子中提取的酯酶的總酯酶活力、比活力及其對(duì)氧化樂(lè)果、敵敵畏、敵百蟲(chóng)3種毒性不同的有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性3個(gè)指標(biāo)的比較，大白豆的總酯酶活力和比活力均高于其它9種，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性也較強(qiáng)，測(cè)定大白豆酯酶對(duì)氧化樂(lè)果、對(duì)硫磷、馬拉對(duì)硫磷、敵敵畏、敵百蟲(chóng)、甲胺磷、樂(lè)果7種常見(jiàn)的有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢測(cè)限，并與國(guó)家(歐盟)規(guī)定允許的最大殘留限量(Maximum Resi

4、due Limit，MRL)比較，發(fā)現(xiàn)大白豆酯酶完全可以滿足有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的需要。
　　 (2)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化，得到大白豆酯酶最佳提取工藝為：大白豆種子粉碎后，按料液比1:5.04，以pH值7.04，濃度0.043mol/L的磷酸緩沖液為提取劑，攪拌95.51 min后，4℃靜置過(guò)夜，8000r/min離心10 rain，大白豆酯酶總酯酶活力為9.84U/mL。
　　 (3)大白豆酯酶粗酶液經(jīng)200

5、0r/min至8000r/min差速離心，60％硫酸銨鹽析，DEAE-32離子交換層析以及Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析后，SDS-PAGE為一條帶，純化倍數(shù)達(dá)111.73，酶活回收率為43.9％。
　　 (4)研究了大白豆酯酶的部分性質(zhì)。研究表明，大白豆酯酶的最適溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為7.5，該酶在溫度25℃～40℃，pH6.5～8.0之間較為穩(wěn)定。該酯酶對(duì)熱不穩(wěn)定，耐酸性不強(qiáng)。Hg2+、Cu2+、Zn2+、F

6、e3+、Ag+對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，其中Cu2+對(duì)此酶抑制作用最強(qiáng)，可使酶活抑制率達(dá)58.29％。Ca2+、Mn2+、Mg2+對(duì)大白豆酯酶活力幾乎沒(méi)有影響，Na+對(duì)其有一定的促進(jìn)作用。大白豆酯酶的最適底物濃度為16mmol/L，雙倒數(shù)作圖法求得Km=0.280mmol/L。
　　 (5)建立了利用大白豆酯酶測(cè)定部分有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法體系。即：酶液添加量為20mL/L，加入α-乙酸萘酯丙酮溶液后，混合均勻，在30℃水浴中反應(yīng)1