鯽魚乙酰膽堿酯酶對有機磷農(nóng)藥敏感性及有機磷農(nóng)藥殘留研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶（Acetyl Cholinesterase，AChE）是一種多分子型糖蛋白，存在于生物體內(nèi)神經(jīng)組織、肝臟、肌肉、紅細胞以及脾臟中，在生物神經(jīng)傳導(dǎo)中起重要作用，其活性受有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥特異性抑制，AChE的活性變化是敏感的農(nóng)藥毒理學(xué)指標，可被應(yīng)用于農(nóng)藥的毒性和環(huán)境污染評價的生物標記物。因而關(guān)于AChE的研究成為環(huán)境、農(nóng)藥、毒理領(lǐng)域的研究熱點。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)中對有機磷農(nóng)藥（Organophosphorus pest

2、icides OPs）較敏感的一類動物，而關(guān)于淡水魚類乙酰膽堿酯酶的研究鮮見報道。
　　 本文首次以淡水魚類鯽魚為對象，提取其腦、肝臟、肌肉中的AChE并進行分離純化，對其生化性質(zhì)進行了研究。進而以六種有機磷農(nóng)藥為抑制劑，探討和評價了鯽魚AChE對有機磷農(nóng)藥的敏感性。建立了兩種有機磷農(nóng)藥敵敵畏和辛硫磷的化學(xué)發(fā)光快速分析方法；建立了鯽魚中辛硫磷殘留量的高效液相色譜分析法。研究結(jié)論如下：
　　 1．以鯽魚、兔、雞為AChE酶

3、源，測定并比較了三種動物以及同一動物的不同部位的蛋白質(zhì)含量，AChE酶活及對有機磷農(nóng)藥敵敵畏的敏感性指標IC50。研究結(jié)果為：七種酶源中，鯽魚腦AChE比酶活最高，達105.59μmol/min.g，而其IC50值僅為8.168μg/mL，為所篩選酶源中的最低值。故確定鯽魚為AChE酶源。
　　 2．首次運用正交實驗法探討了鯽魚腦、肝臟、肌肉中AChE的提取條件的優(yōu)化組合。研究結(jié)論為：鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶的最佳提取條件

4、為，提取液為pH值為8.0的磷酸鹽緩沖溶液、勻漿比為1：4。在此條件下鯽魚腦、肝臟和肌肉中AChE的比酶活最高，比酶活力值最大。其AChE比酶活分別為149μmol/min.g，13μmol/min．g和262μmol/min.g。
　　 3．運用中心組合實驗和響應(yīng)面分析法得鯽魚腦、肝、肌肉AChE比酶活測定最佳條件組合為，魚腦酶活測定的最佳條件為保溫時間35min，保溫溫度32℃，pH值7.6。肝臟酶活測定的最佳條件為保溫時間

5、28mm，保溫溫度30℃，pH值7.6。肌肉酶活測定的最佳條件為保溫時間31min，保溫溫度31℃，pH值7.6。
　　 4．鯽魚腦、肝、肌肉AChE的生化性質(zhì)參數(shù)及對六種有機磷農(nóng)藥的敏感性評價指標結(jié)果如下：
　　 4.1鯽魚腦部、肝臟、肌肉中AChE粗提取液的米氏常數(shù)Km值分別為1.063mmol/L，7.864mmol/L，4.028mmol/L；最大反應(yīng)速度Vmax值分別為52.91mmol/(L.min)，31.

6、746mmol/(L.min)，135.13mmol/(L.min);測得Km值可知：在有機磷農(nóng)藥敵敵畏抑制條件下，鯽魚腦部乙酰膽堿酯酶與底物親和力最強，其次是肌肉，肝臟中乙酰膽堿酯酶與底物親和力最弱。
　　 4.2鯽魚腦部、肝臟、肌肉中AChE粗提取液對有機磷農(nóng)藥敵敵畏的雙分子速率常數(shù)Ki值分別為1.011L/(g.min)，0.472L/(g.min)，0.173L/(g.min)。由測得Ki值可知：對于有機磷農(nóng)藥敵敵畏的抑

7、制，鯽魚腦部乙酰膽堿酯酶的敏感性最強，其次是肝臟，肌肉中乙酰膽堿酯酶的敏感性最弱。
　　 4.3通過測定鯽魚腦部、肝臟、肌肉中AChE粗酶液對六種有機磷農(nóng)藥的IC50值，分析比較可得以下結(jié)論：
　　 鯽魚腦部AChE粗酶液對六種有機磷農(nóng)藥的敏感性由強到弱分別為：敵敵畏＞辛硫磷＞殺螟松＞三唑磷＞樂果＞倍硫磷。
　　 鯽魚肝臟AChE粗酶液對六種有機磷農(nóng)藥的敏感性由強到弱分別為：敵敵畏＞辛硫磷＞殺螟松＞樂果＞倍硫磷＞

8、三唑磷。
　　 鯽魚肌肉AChE粗酶液對六種有機磷農(nóng)藥的敏感性由強到弱分別為：敵敵畏＞三唑磷＞辛硫磷＞殺螟松＞樂果＞倍硫磷。
　　 4.4六種有機磷農(nóng)藥和膽堿酯酶強抑制劑毒扁豆堿對乙酰膽堿酯酶的抑制效應(yīng)比較結(jié)果為：
　　 鯽魚各部分AChE對敵敵畏和毒扁豆堿表示出較強的敏感性，抑制曲線隨時間呈良好的上升趨勢，而其中肝臟的酶構(gòu)成種類復(fù)雜，例如有超氧化物歧化酶(SOD)等，干擾較大，使趨勢曲線雜亂。
　　 5

9、．對鯽魚腦和肝臟AChE進行了純化和初步結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，鯽魚肝臟AChE粗酶液經(jīng)聚乙二醇雙水相萃取，DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析后純化后，純化倍數(shù)達145倍。
　　 鯽魚腦AChE粗酶液經(jīng)聚乙二醇雙水相萃取，DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析和Sephadex G-200純化后得到了較純的乙酰膽堿酯酶(AChE)，純化倍數(shù)達214倍。經(jīng)紫外吸收光譜、紅外光譜和圓二色譜分析證明，鯽魚腦AC

10、hE純化最終產(chǎn)物具有蛋白質(zhì)和酶的相關(guān)結(jié)構(gòu)特征。
　　 6．建立了鯽魚AChE為之敏感性高的兩種有機磷農(nóng)藥敵敵畏和辛硫磷在實際樣品種的化學(xué)發(fā)光快速分析方法，方法評價指標為：
　　 6.1.在最佳反應(yīng)條件下，辛硫磷濃度在1.0×10-8g/mL-1.0×10-6g/mL范圍內(nèi)時，△I與辛硫磷濃度成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=121.43x+95232，相關(guān)系數(shù)r為0.9979，檢出限為5.4×10-9g/mL;敵敵畏濃

11、度在8.0×10-8g/mL-1.0×10-5g/mL范圍內(nèi)時，△I與敵敵畏濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=2013.7x+13292，相關(guān)系數(shù)為r=0.9997，檢出限為6.0×10-8g/mL。
　　 6.2.采用化學(xué)發(fā)光法和氣相色譜法檢測實際樣品（小白菜）中辛硫磷含量，結(jié)果基本吻合；在實際樣品（大白菜和生菜）中未檢出敵敵畏，向?qū)嶋H樣品中添加己知濃度的敵敵畏做回收率實驗，回收率分別達124％和115%，達到了農(nóng)藥殘

12、留分析相關(guān)要求。
　　 6.3.經(jīng)紫外吸收光譜和熒光光譜驗證，確定兩種有機磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機理為，魯米諾溶液的最大發(fā)射波長在λmax=420nm處，發(fā)光體是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。向魯米諾中加入H2O2后并沒有新的發(fā)光物質(zhì)生成，發(fā)光體仍然是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。加入辛硫磷和敵敵畏后體系的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生改變，說明發(fā)光體仍舊是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。
　　 7．建立了鯽魚體內(nèi)辛硫磷殘