高危HPVE6-E7型內(nèi)變體在宮頸癌和前體病變中的分布及其SNP芯片的研發(fā).pdf

1、宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，據(jù)國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)2002年統(tǒng)計(jì)表明，全世界每年約49．3萬(wàn)新發(fā)病例和27．4萬(wàn)死亡病例，其中80％以上發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。大量的研究已證實(shí)人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌及前體病變發(fā)生的必要因素，但僅有HPV感染并不能夠?qū)е聦m頸癌的發(fā)生，很多的病毒和非病毒的因素影響宮頸癌的發(fā)生。其中，病毒本身因素有以下幾個(gè)方面：HPV類型，HR—HPV持續(xù)感染，病毒基因編碼蛋白尤其是E6/E7蛋白，最近研究還表明HR—HPV型

2、內(nèi)基因組變異與HPV持續(xù)感染和官頸病變的進(jìn)展有關(guān)。
　　 在全世界范圍內(nèi)，人乳頭瘤病毒16(HPV16)是宮頸癌發(fā)生的最主要病因。研究表明HPV58/52在亞洲(包括中國(guó))婦女中是較普遍存在的亞型?；谝詫m頸脫落細(xì)胞涂片為主的宮頸癌篩查的普及及推廣，最近60年官頸癌的發(fā)生率在全世界范圍內(nèi)有普遍下降趨勢(shì)，盡管宮頸脫落細(xì)胞涂片特異性高、方法簡(jiǎn)便、且無(wú)創(chuàng)傷性，長(zhǎng)期以來一直是宮頸癌篩查中唯一的初篩手段，但是細(xì)胞學(xué)篩查的敏感性較低，從而導(dǎo)

3、致一部分患者被漏診得不到早期的診斷和治療。HR—HPV作為宮頸癌獨(dú)立發(fā)病因素的事實(shí)提示，HR—HPV檢測(cè)也可作為宮頸癌篩查的一種手段。盡管HPV檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于其高敏感性和高陰性預(yù)測(cè)值，但它作為初篩手段卻受到其低特異性和低陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的限制。已經(jīng)證實(shí)，只有HR—HPV持續(xù)感染才能導(dǎo)致宮頸癌及其前期病變的發(fā)生。因此，尋找一種能預(yù)測(cè)哪些HR—HPV陽(yáng)性病人可能會(huì)持續(xù)感染并發(fā)展為宮頸高級(jí)別病變和宮頸癌的方法，作為HR—HPV陽(yáng)性而細(xì)胞學(xué)陰性病人的

4、分層處理，對(duì)降低隨訪的盲目性、提高宮頸癌篩查的效率和準(zhǔn)確性及節(jié)約社會(huì)經(jīng)濟(jì)資源均有極其重要的意義。
　　 本研究首先檢測(cè)中國(guó)婦女中常見致癌亞型HPV16、HPV58、和HPV52的E6/E7基因變異情況，并分析這些變異與侵襲性官頸癌(ICC)及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)發(fā)生的相關(guān)性；然后根據(jù)不同病變之間HPV型內(nèi)基因組的變異差異情況建立一種能更早期，更特異的預(yù)測(cè)宮頸高級(jí)病變或侵襲性官頸癌的篩查方法。
　　 第一部分
　

5、　 目的：了解來自浙江省宮頸癌及其前體病變婦女的HPV16/58/52 E6和E7變體的分布情況及其致癌潛能。
　　 方法：標(biāo)本收集自2008年4月至2009年12月期間，于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院宮頸門診就診的病人，這些病人全部為HPV陽(yáng)性病人，年齡為21—73歲，平均年齡38歲。共收集2021例宮頸標(biāo)本，其中HV16陽(yáng)性170例，HPV58陽(yáng)性177例，HPV52陽(yáng)性121例。按組織病理分型包括，宮頸上皮內(nèi)瘤變1級(jí)(C

6、IN1)60例，宮頸上皮內(nèi)瘤變2—3級(jí)(CIN2—3)129例，侵襲性官頸癌(ICC)59例，正常對(duì)照220例。所有的病人都簽署知情同意書。采用酚—氯仿法提取DNA之后，對(duì)這些DNA標(biāo)本采用導(dǎo)流雜交法進(jìn)行HPV分型，符合要求的DNA標(biāo)本直接用型特異性引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，NCBI在線BLAST比對(duì)結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.HPV16 E6/E7變體本研究發(fā)現(xiàn)HPV16亞洲種系是最常見的變體(77％)，而在亞洲

7、系中，亞洲變體與ICC及CIN有顯著相關(guān)性。本研究首次發(fā)現(xiàn)以下新的變異體：HPV16E6(Q20P，H118Q，Q123K)和HPV16E7(D75N，T86P)。并且我們發(fā)現(xiàn)HPV16E6G368T變異能導(dǎo)致E6基因編碼蛋白的提前終止，但這個(gè)變異僅存在于一例正常對(duì)照中。
　　 2.HPV58 E6/E7變體本研究發(fā)現(xiàn)了15個(gè)目前文獻(xiàn)中尚未報(bào)道過的變異位點(diǎn)，其中，5個(gè)HPV58E6變異，10個(gè)HPV58E7，有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)

8、HPV58E7 C632T(T20I)和G760A(G63S)變異位點(diǎn)通常出現(xiàn)在同一標(biāo)本中，并且與宮頸瘤變的程度成正相關(guān)性(Ptrend<0．05)。
　　 3.HPV52 E6/E7變體本研究發(fā)現(xiàn)了14個(gè)目前文獻(xiàn)中尚未報(bào)道過的變異位點(diǎn)，3個(gè)HPV52E6和11個(gè)HPV52E7變異，最常見的變異是HPV52E6 A379G(K93R)，HPV52E7 C751T和A801G。
　　 結(jié)論：
　　 1.HPV16/

9、58/52 E6和E7變體在浙江省婦女中的分布與其他地區(qū)的有所不同，其中34個(gè)變異位點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道。
　　 2.HPV16亞洲變體(As—V)和HPV58 E7 C632T(T20I)及G760A(G63S)變體具有更高的致癌潛能。
　　 第二部分
　　 目的：通過分析HR—HPVE6/E7基因型內(nèi)變異在官頸癌及其前期病變中的分布差異，定制包含差異位點(diǎn)的SNP芯片，以期用于宮頸癌篩查。
　　 方法：選

10、取經(jīng)HPV分型確定為單純HPV16/58/18/52陽(yáng)性，并通過測(cè)序(第一部分)確定包含差異SNP位點(diǎn)的患者標(biāo)本51例做為陽(yáng)性對(duì)照，這些標(biāo)本共包括35個(gè)SNP位點(diǎn)，通過文獻(xiàn)查閱，選擇在CIN和ICC中出現(xiàn)頻率相對(duì)高的SNP位點(diǎn)，與前期測(cè)序有差異的35個(gè)位點(diǎn)，共計(jì)70個(gè)SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)每個(gè)點(diǎn)的核酸探針，定制SNPT芯片。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)中，共設(shè)計(jì)了1689條探針，進(jìn)行了4輪雜交實(shí)驗(yàn)，獲得了四張芯片雜交結(jié)果圖，包括HPV16E6

11、混合標(biāo)本和單一標(biāo)本的芯片雜交結(jié)果，四種HPV類型7個(gè)基因單一標(biāo)本的探針雜交結(jié)果和7個(gè)基因混合標(biāo)本的探針雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HPVE6/E7型內(nèi)基因變異芯片檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果一致，芯片雜交的重復(fù)性好，不同的HPV類型間無(wú)交叉雜交現(xiàn)象，但存在5％的漏診率。
　　 結(jié)論：
　　 1.我們研發(fā)的HPVE6/E7型內(nèi)變異芯片能準(zhǔn)確檢測(cè)相距較遠(yuǎn)的單個(gè)位點(diǎn)的變異和同時(shí)存在的多個(gè)位點(diǎn)的變異，但存在5．0％左右的漏檢率，尚有待進(jìn)一步改進(jìn)。<