重型再生障礙性貧血骨髓造血免疫損傷機制的研究.pdf

1、目的：
　　應用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation，iTRAQ)技術，對重型再生障礙性貧血(Severe Aplastic Anemia，SAA)患者與正常人骨髓CD34+細胞的蛋白質成分進行分析，獲得SAA骨髓CD34+細胞疾病特異性的蛋白質組差異表達圖譜，初步篩選導致SAA免疫功能亢進的自身抗原，為進一步闡明SAA免疫發(fā)病機制提供理論

2、依據(jù)。
　　通過檢測SAA患者外周血血清白介素(IL)-17水平，分析其與T淋巴細胞亞群、樹突細胞(DC)亞群、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)以及血常規(guī)之間相關性，初步探討IL-17與SAA的關系，為尋找新的SAA治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　研究對象為天津醫(yī)科大學總醫(yī)院血液科自2013年1月至2014年2月收治的初治SAA患者、治療后恢復期的SAA患者及正常對照者。
　　第一部分建立SAA骨髓CD34+細胞

3、差異蛋白質表達圖譜，應用免疫磁珠法分選29例SAA恢復期患者及10名健康正常人骨髓CD34+細胞，提取總蛋白并將蛋白質酶解，應用iTRAQ試劑標記樣品，應用多維液相色譜分離樣品并串聯(lián)質譜Q Exactive進行蛋白質分析，應用數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質，并比較這些蛋白質的表達差異，初步探索導致SAA免疫功能亢進的抗原物質。
　　第二部分探討白介素IL-17在SAA患者發(fā)病機制中的作用，采用流式液相多重蛋白定量技術(CBA)檢測25例SA

4、A初治患者、15例SAA恢復期患者及10名健康正常人外周血血清IL-17水平，同時應用單克隆抗體標記及流式細胞術檢測T細胞亞群(CD4+/CD8+比值)、DC（髓樣樹突細胞/淋系樹突細胞比值，mDC/pDC比值）、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)比例，分析血清IL-17水平與T亞群、DC亞群、Treg比例及血常規(guī)相關性。
　　結果：
　　第一部分獲得SAA骨髓CD34+細胞的蛋白質組差異表達圖譜。以蛋白質置信度＞95％及鑒定肽段蛋白

5、質假陽性率＜1％為限，共鑒定肽段15120個，蛋白3208個。以差異蛋白Ratio（病例組/對照組）大于2.794和小于0.323并且置信度＞95％為限，共篩選出高可信的差異蛋白157個，其中上調(diào)蛋白54個，下調(diào)蛋白103個。差異蛋白涉及的生理功能包含以下幾方面:細胞凋亡、細胞周期、RNA剪接及代謝、蛋白質修飾及轉運、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白質降解等。
　　第二部分 SAA初治組IL-17水平為17.07±15.18 pg/m

6、l，明顯高于恢復組(7.09±3.84pg/ml，P＜0.01)和對照組(3.53±2.08 pg/ml，P＜0.01);SAA恢復組IL-17水平亦明顯高于對照組(P＜0.05)。初治組CD4+/CD8+比值為0.32±0.08明顯低于恢復組（1.11±0.31，P＜0.01）及對照組(1.07±0.26，P＜0.01);初治組mDC/pDC比值為3.16±0.55明顯高于恢復組（1.6±0.43，P＜0.01）及對照組（1.43±0

7、.38，P＜0.01）;初治組Treg占外周血單個核比例(CD4+CD25+CD127dim/PBL)為0.8±0.31％明顯低于恢復組（1.78±0.69％，P＜0.01）及對照組(2.23±0.66％，P＜0.01)。初治組IL-17水平和CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+CD127dim/PBL均呈負相關（r=-0.421，P＜0.05; r=-0.65，P＜0.01）;與mDC/pDC比值呈正相關(r=0.414，P＜0

8、.05);與白細胞水平呈負相關（r=-0.689，P＜0.01）;恢復組IL-17水平與白細胞水平呈負相關(r=-0.64，P＜0.05)。
　　結論：
　　1.成功獲得了SAA患者骨髓CD34+細胞的蛋白質組差異表達圖譜，并且證明iTRAQ標記串聯(lián)質譜技術用于SAA患者骨鏈細胞的差異蛋白質組學分析是一種有效的方法。本次差異蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)157個在SAA骨髓CD34+細胞中表達異常的蛋白質，差異蛋白功能主要涉及細胞凋亡、