重型再生障礙性貧血骨髓造血免疫損傷機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation，iTRAQ)技術(shù)，對重型再生障礙性貧血(Severe Aplastic Anemia，SAA)患者與正常人骨髓CD34+細(xì)胞的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行分析，獲得SAA骨髓CD34+細(xì)胞疾病特異性的蛋白質(zhì)組差異表達(dá)圖譜，初步篩選導(dǎo)致SAA免疫功能亢進(jìn)的自身抗原，為進(jìn)一步闡明SAA免疫發(fā)病機(jī)制提供理論

2、依據(jù)。
　　通過檢測SAA患者外周血血清白介素(IL)-17水平，分析其與T淋巴細(xì)胞亞群、樹突細(xì)胞(DC)亞群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)以及血常規(guī)之間相關(guān)性，初步探討IL-17與SAA的關(guān)系，為尋找新的SAA治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　研究對象為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科自2013年1月至2014年2月收治的初治SAA患者、治療后恢復(fù)期的SAA患者及正常對照者。
　　第一部分建立SAA骨髓CD34+細(xì)胞

3、差異蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，應(yīng)用免疫磁珠法分選29例SAA恢復(fù)期患者及10名健康正常人骨髓CD34+細(xì)胞，提取總蛋白并將蛋白質(zhì)酶解，應(yīng)用iTRAQ試劑標(biāo)記樣品，應(yīng)用多維液相色譜分離樣品并串聯(lián)質(zhì)譜Q Exactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)，并比較這些蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，初步探索導(dǎo)致SAA免疫功能亢進(jìn)的抗原物質(zhì)。
　　第二部分探討白介素IL-17在SAA患者發(fā)病機(jī)制中的作用，采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測25例SA

4、A初治患者、15例SAA恢復(fù)期患者及10名健康正常人外周血血清IL-17水平，同時(shí)應(yīng)用單克隆抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群(CD4+/CD8+比值)、DC（髓樣樹突細(xì)胞/淋系樹突細(xì)胞比值，mDC/pDC比值）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比例，分析血清IL-17水平與T亞群、DC亞群、Treg比例及血常規(guī)相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　第一部分獲得SAA骨髓CD34+細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異表達(dá)圖譜。以蛋白質(zhì)置信度＞95％及鑒定肽段蛋白

5、質(zhì)假陽性率＜1％為限，共鑒定肽段15120個(gè)，蛋白3208個(gè)。以差異蛋白Ratio（病例組/對照組）大于2.794和小于0.323并且置信度＞95％為限，共篩選出高可信的差異蛋白157個(gè)，其中上調(diào)蛋白54個(gè)，下調(diào)蛋白103個(gè)。差異蛋白涉及的生理功能包含以下幾方面:細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、RNA剪接及代謝、蛋白質(zhì)修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解等。
　　第二部分 SAA初治組IL-17水平為17.07±15.18 pg/m

6、l，明顯高于恢復(fù)組(7.09±3.84pg/ml，P＜0.01)和對照組(3.53±2.08 pg/ml，P＜0.01);SAA恢復(fù)組IL-17水平亦明顯高于對照組(P＜0.05)。初治組CD4+/CD8+比值為0.32±0.08明顯低于恢復(fù)組（1.11±0.31，P＜0.01）及對照組(1.07±0.26，P＜0.01);初治組mDC/pDC比值為3.16±0.55明顯高于恢復(fù)組（1.6±0.43，P＜0.01）及對照組（1.43±0

7、.38，P＜0.01）;初治組Treg占外周血單個(gè)核比例(CD4+CD25+CD127dim/PBL)為0.8±0.31％明顯低于恢復(fù)組（1.78±0.69％，P＜0.01）及對照組(2.23±0.66％，P＜0.01)。初治組IL-17水平和CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+CD127dim/PBL均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.421，P＜0.05; r=-0.65，P＜0.01）;與mDC/pDC比值呈正相關(guān)(r=0.414，P＜0

8、.05);與白細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.689，P＜0.01）;恢復(fù)組IL-17水平與白細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.成功獲得了SAA患者骨髓CD34+細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異表達(dá)圖譜，并且證明iTRAQ標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于SAA患者骨鏈細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析是一種有效的方法。本次差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)157個(gè)在SAA骨髓CD34+細(xì)胞中表達(dá)異常的蛋白質(zhì)，差異蛋白功能主要涉及細(xì)胞凋亡、