禽類病原體抗原在蘇云金芽胞桿菌細胞表面的展示.pdf

1、本研究在國內(nèi)外首次利用來自蘇云金芽胞桿菌的S-層蛋白在蘇云金芽胞桿菌細胞表面成功展示了禽流感病毒核衣殼蛋白NP和血凝素蛋白HA1以及雞毒霉形體粘附素蛋白pMGA等禽類病原體抗原，從而為用蘇云金芽胞桿菌投遞病原體抗原來研制熱穩(wěn)定性禽用口服疫苗探明了科學(xué)道路。 1.檢測S-層表面展示系統(tǒng)中的受體菌株及載體質(zhì)粒對小鼠和雛雞的安全性 為了檢測展示系統(tǒng)中的受體菌株蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171和載體質(zhì)粒pHT304的安全性

2、，將質(zhì)粒pHT304電轉(zhuǎn)化入BMB171中，得到菌株BMB304。以BMB304作為受試菌株，對小鼠和雛雞進行安全性測試，并考察BMB304在雞腸道中的存留情況，以探索用蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株作為外源抗原的載體以研制疫苗的可行性。 小鼠腹腔一次性注射含10<'10>BMB304 營養(yǎng)細胞液1.0mL，觀察14天，未發(fā)現(xiàn)有急性毒性反應(yīng)。小鼠飲用含10<'8>、10<'7>和10<'6>BMB304營養(yǎng)細胞/mL的飲用水28天，

3、各組小鼠精神和飲食正常，病理解剖學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常變化，各劑量組小鼠體重變化、臟器系數(shù)、血常規(guī)指標及血液生化指標與對照組相比無顯著性差異。雛雞24小時內(nèi)灌服含10<'10>BMB304芽胞液1.0mL，14天內(nèi)未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)。飼喂雛雞含10<'8>、10<'8>和10<'6> BMB304芽胞/g飼料28天，雛雞精神和飲食正常，病理解剖學(xué)檢查未見任何異常，各劑量組的日增重與對照組相比差異不顯著。飼喂雛雞含 10<'6>BMB304芽胞

4、/g飼料3天后，經(jīng)測定，芽胞能在雞腸道中萌發(fā)并至少存留5天但不超過7天。結(jié)果表明，受體菌株BMB171和載體質(zhì)粒pHT304對小鼠和雛雞安全無毒，且能在雞腸道內(nèi)暫時定殖，能作為外源抗原的載體以研制疫苗之用。 2.構(gòu)建含禽類病原體抗原基因的S-層融合蛋白基因 通過PCR擴增分別得到欲展示的病原體抗原基因np、npp、ha1p和pmga1.2p。用抗原基因片段替換S-層蛋白 ctc 基因表面錨定序列slh下游的3’-端或中部

5、片段，分別獲得了2個含 np 基因的重組質(zhì)粒pSNP和pCSA-SNP；2個含npp基因的重組質(zhì)粒pCTC-NPP和pCSNPP；2個含ha1p基因的重組質(zhì)粒pCTC-HA1P和pCSHA1P；2個含 pmga1.2p 基因的重組質(zhì)粒 pCTC-PMGA1.2P和pCSPMGA1.2P。其中在構(gòu)建pCSA-SNP、pCSNPP、pCSHA1P和pCSPMGA1.2P這4個重組質(zhì)粒時，在S-層融合蛋白基因的上游插入了 csaAB操縱元，c

6、saAB操縱元對S-層蛋白錨定到細胞表面起重要作用。 3.構(gòu)建含S-層融合蛋白基因的重組菌株 將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入受體菌株BMB171中，分別獲得了5個展示NP蛋白的重組菌株BN(含pSNP)、BCN(含pSNP和pMIL-CSA)、C-S(含pCSA-SNP)、BCCN(含pCTC-NPP和pMIL-CSA)和CN(含 pCSNPP)；2個展示 HA1 蛋白的重組菌株BCCH(含pCTC-HA1P和pMIL-CSA)和C

7、H(含pCSHA1P)；2個展示pMGA蛋白的重組菌株BCCG(含pCTC-PMGA1.2P和pMIL-CSA)和CG(含pCSPMGA1.2P)。其中質(zhì)粒pMIL-CSA攜帶有csaAB操縱元，在轉(zhuǎn)化不含csaAB操縱元的重組質(zhì)粒時要同時轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒，以便給受體菌株提供csaAB操縱元。 4.檢測外源抗原蛋白在重組菌株細胞表面的展示情況 用玻片凝集試驗檢測5個展示NP蛋白的重組菌株的表面展示情況，用血凝和血凝抑制試驗檢測

8、2個展示HA1蛋白和2個展示pMGA蛋白的重組菌株的表面展示情況。結(jié)果，所有的重組菌株均表現(xiàn)出了預(yù)計的生物學(xué)活性，說明所構(gòu)建的S-層融合蛋白基因在受體菌株中得到表達并展示到了細胞表面且具有活性。 5.檢測重組菌株對小鼠和雛雞的免疫原性 用9個重組菌株的營養(yǎng)細胞分別通過腹腔注射途徑免疫SPF級BALB/c小白鼠，用間接ELISA測定小白鼠血清抗體效價。結(jié)果，小鼠產(chǎn)生了針對相應(yīng)外源抗原的抗體，其抗體水平與作為對照的受體菌株B

9、MB171相比差異極顯著，說明所構(gòu)建的重組菌株具有免疫原性。 將展示HA1蛋白的重組菌株BCCH和CH以及展示pMGA蛋白的重組菌株BCCG和CG培養(yǎng)至芽胞形成期，用重組菌株的芽胞液通過口服途徑免疫艾維因商品代肉雛雞，用血凝抑制試驗測定接種BCCH和CH的雞的血清抗體效價，用血清平板凝集試驗測定接種BCCG和CG的雞的血清抗體效價。結(jié)果，實驗雞產(chǎn)生了針對相應(yīng)外源抗原的抗體，其抗體水平與作為對照的受體菌株BMB171相比差異極顯著