殺甘薯莖線蟲的蘇云金芽胞桿菌篩選及特性研究.pdf

1、甘薯莖線蟲病是制約我國(guó)甘薯生產(chǎn)的三大嚴(yán)重病害之一,近年來已成為北方薯區(qū)最嚴(yán)重的病害。傳統(tǒng)防治甘薯莖線蟲病的方法主要有輪作換茬、藥劑防治和選育抗病品種等,但因其高投入低效率和產(chǎn)生的環(huán)境問題而暴露出很大的局限性。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)由于其特異性的高毒力、對(duì)人畜無害和不污染環(huán)境等特點(diǎn),作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治植物寄生線蟲的微生物殺蟲劑已得到一定應(yīng)用,但是到目前為止利用Bt防治甘薯莖線蟲的研究卻未見公開

2、報(bào)道。本研究以已經(jīng)報(bào)道的對(duì)一些動(dòng)植物寄生線蟲有活性的Bt菌株為供試菌株,篩選得到了對(duì)甘薯莖線蟲具有高毒力的YBT-008菌株,利用SDS-PAGE、LC-MS和PCR等方法驗(yàn)證了YBT-008可編碼的四個(gè)殺蟲晶體蛋白基因cyt2Ba,cry11Aa,cry4Aa和cry4Ba,進(jìn)而構(gòu)建重組載體并使其表達(dá),最后分別測(cè)定了已表達(dá)蛋白對(duì)甘薯莖線蟲的殺蟲活性,旨在尋找到殺甘薯莖線蟲的Bt新型基因和蛋白資源。
　　 1.篩選了一株對(duì)甘薯莖

3、線蟲具有高毒力的Bt菌株YBT-008。初篩以已經(jīng)報(bào)道的對(duì)動(dòng)植物寄生線蟲有活性的12株Bt菌株為供試菌株,提取其殺蟲晶體蛋白,分別測(cè)定在3 d和7 d時(shí)對(duì)供試線蟲的致死率；初篩得到了三株對(duì)供試線蟲致死率在50％以上的Bt菌株；將其生測(cè)樣品稀釋兩倍后,按同樣方法進(jìn)行生物測(cè)定,此為復(fù)篩。通過初篩和復(fù)篩我們得到了一株對(duì)甘薯莖線蟲具有高毒力的Bt菌株YBT-008,相較其余菌株殺蟲效果明顯,其對(duì)甘薯莖線蟲的LC50值為203.76μg/mL。<

4、br>　　 2.驗(yàn)證了YBT-008可編碼的四個(gè)殺蟲晶體蛋白基因。鏡檢觀察到Y(jié)BT-008在芽胞形成過程中可形成具明顯形態(tài)特征的伴胞晶體蛋白,通過SDS—PAGE和LC-MS分析,鑒定出YBT-008可產(chǎn)生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa和Cyt2Ba四種殺蟲晶體蛋白；設(shè)計(jì)特異性引物對(duì),對(duì)上述四個(gè)殺蟲晶體蛋白基因的PCR擴(kuò)增進(jìn)一步驗(yàn)證了YBT-008基因組內(nèi)含有cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba殺蟲晶體

5、蛋白基因。
　　 3.克隆并表達(dá)了cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba四個(gè)殺蟲晶體蛋白基因。設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增上述四個(gè)基因的全長(zhǎng)編碼序列,將其連接到穿梭載體pHT304上,并轉(zhuǎn)化到Bt無晶體突變株BMB171中,鏡檢和SDS-PAGE結(jié)果表明上述四個(gè)蛋白均已獲得表達(dá)。
　　 4.檢測(cè)了Cyt2Ba和Cry4Ba對(duì)甘薯莖線蟲的殺蟲活性。提取上述表達(dá)成功的晶體蛋白,分別檢測(cè)了其對(duì)甘薯莖線蟲的殺