TMEM16A對高肺血流性肺動脈高壓調(diào)控機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 TMEM16A在高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞上的表達及特征
　　目的:驗證TMEM16A在大鼠肺動脈平滑肌細胞上的表達及分布規(guī)律，探索可能由TMEM16A介導的CaCC的電生理學特點。
　　方法:將SD大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組和分流組。通過腹主動脈-下腔靜脈造瘺分流法建立高肺血流性肺動脈高壓大鼠模型，術(shù)后11周測定肺動脈壓力。HE染色及免疫組化檢測TMEM

2、16的分布;qRT-PCR檢測TMEM16A mRNA在各組肺動脈平滑肌細胞的表達水平;Westem blot檢測TMEM16A蛋白的表達;全細胞膜片鉗記錄CaCC電生理學特點。
　　結(jié)果:分流組大鼠肺動脈壓力較正常組和假手術(shù)組顯著上升(P＜0.01)，提示分流手術(shù)成功建立高肺血流性肺動脈高壓動物模型。HE染色病理檢查可見分流組大鼠肺小動脈管壁增厚、管腔狹窄。免疫組織化學染色顯示TMEM16A主要分布于肺動脈平滑肌細胞膜。qRT-

3、PCR結(jié)果顯示，分流組TMEM16A mRNA表達水平較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01)，而正常組和假手術(shù)組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。Westernblot結(jié)果顯示，分流組TMEM16A蛋白表達水平較正常組和假手術(shù)組均顯著增高(P＜0.01)，而正常組和假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。通過全細胞膜片鉗實驗在肺動脈平滑肌細胞記錄到穩(wěn)定的CaCC電生理特征，其表現(xiàn)出外向整流性和Ca2+敏感性。分流組肺動脈平滑肌

4、細胞的電流密度較正常組和假手術(shù)組顯著增高，I-V曲線上移（P＜0.01），而正常組和假手術(shù)組之間電流密度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)TMEM16A在高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞上存在高表達，可能參與了肺動脈高壓的發(fā)生過程。(2)高肺血流性肺動脈高壓發(fā)生過程中，肺動脈平滑肌細胞膜上電流及電流密度增高，可能是肺動脈高壓的發(fā)生機制之一。
　　第二部分 TMEM16A對高肺血流性肺動脈高壓中鈣激活性氯

5、離子通道的調(diào)控作用
　　目的:為了進一步探索高肺血流性肺動脈高壓中TMEM16A是否調(diào)控肺動脈平滑肌細胞上的CaCC及其電生理變化，我們通過構(gòu)建慢病毒載體、RNAi技術(shù)下調(diào)TMEM16A基因的表達，從而為進一步闡明TMEM16A在高肺血流性肺動脈高壓中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:根據(jù)第一部分建立的高肺血流性肺動脈高壓動物模型，動物分組、肺動脈壓力測定、原代肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)均同第一部分。利用RNAi技術(shù)，制備慢病毒載體后進

6、行慢病毒包裝，對特異性目的基因TMEM16A進行細胞轉(zhuǎn)染。通過qRT-PCR和Western blot分別檢測慢病毒對TMEM16A基因mRNA和蛋白的干擾效率。篩選出最高效率的干擾載體，通過qRT-PCR和Western blot分別檢測肺動脈平滑肌細胞轉(zhuǎn)染前后TMEM16A基因mRNA和蛋白表達量的變化。全細胞膜片鉗實驗檢測細胞轉(zhuǎn)染前后電生理變化。
　　結(jié)果:經(jīng)過慢病毒載體的制備、慢病毒包裝和細胞轉(zhuǎn)染等步驟，順利將帶有綠色熒光

7、的慢病毒轉(zhuǎn)染至肺動脈平滑肌細胞中。qRT-PCR和Western blot方法篩選出具有最高效率的干擾載體(83％)。對轉(zhuǎn)染前后各組肺動脈平滑肌細胞的TMEM16A mRNA表達量進行比較，正常組、假手術(shù)組和分流組的表達量較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染前后各組肺動脈平滑肌細胞的TMEM16A蛋白表達量進行比較，正常組、假手術(shù)組和分流組的表達量均較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降（P＜0.05）。正常組、假手術(shù)組和分流組肺動脈平滑肌細胞

8、在轉(zhuǎn)染前后電流顯著下降，電流密度均較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染后分流組CaCC電流密度較轉(zhuǎn)染后正常組（P＜0.01）和假手術(shù)組(P＜0.05)均顯著增加，而轉(zhuǎn)染后正常組與轉(zhuǎn)染后假手術(shù)組CaCC電流密度之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建表達TMEM16A基因siRNA的慢病毒載體并篩選出具有較高干擾效率的RNA干擾載體。(2)經(jīng)RT-PCR和Western blot證實，通過細胞轉(zhuǎn)染方式有效

9、降低TMEM16A mRNA和蛋白表達，降低細胞膜電流及電流密度。(3)TMEM16A通過調(diào)控CaCC的方式參與高肺血流性肺動脈高壓的發(fā)生。
　　第三部分 TMEM16A對高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的影響及作用途徑
　　目的:第二部分通過細胞轉(zhuǎn)染的方式下調(diào)TMEM16A基因的表達，為進一步研究該基因在高肺血流性肺動脈高壓的發(fā)生過程中的作用提供了重要的反向功能研究手段。因此我們繼續(xù)利用這一技術(shù)方法，探索TME

10、M16A對肺動脈平滑肌細胞增殖功能的影響及其可能作用的信號通路。
　　方法:根據(jù)第一部分建立的高肺血流性肺動脈高壓動物模型，動物分組、肺動脈壓力測定、原代肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)均同前述部分，以肺動脈平滑肌細胞為實驗對象，利用第二部分建立的RNA干擾載體進行后續(xù)實驗。通過MTT實驗檢測各組肺動脈平滑肌細胞增殖變化，應用Westernblot檢測PCNA、P-ERK、ERK蛋白的表達。
　　結(jié)果:細胞接種后48小時后，肺動脈平滑肌

11、細胞逐步進入對數(shù)生長期，分流組增殖活性較正常組和假手術(shù)組明顯增高(P＜0.01)，而正常組與假手術(shù)組之間無差異(P＞0.05)。各組肺動脈平滑肌細胞進行針對TMEM16A基因的轉(zhuǎn)染，敲低TMEM16A基因的各組細胞增殖速度均顯著下降(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染前分流組肺動脈平滑肌細胞PCNA表達量較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01)，而正常組與假手術(shù)組之間無差異（P＞0.05）。比較轉(zhuǎn)染前后細胞PCNA表達量的變化，敲低TMEM16A基

12、因的各組細胞PCNA表達量均顯著下降(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染前分流組肺動脈平滑肌細胞的P-ERK/ERK較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.05)，而正常組與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。比較轉(zhuǎn)染前后細胞P-ERK/ERK變化，敲低TMEM16A基因的各組細胞P-ERK/ERK均顯著下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)TMEM16A促進大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖，從而參與高肺血流性肺動脈高壓的發(fā)生。(2)TMEM