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文檔簡(jiǎn)介
1、肝臟淋巴系統(tǒng)(lymphatic system)不僅是組織回流系統(tǒng),而且是免疫控制系統(tǒng)。肝臟淋巴管道作為肝組織的回流系統(tǒng),是對(duì)血液回流系統(tǒng)重要的補(bǔ)充,在維持肝臟正常功能中起重要作用。目前對(duì)于肝臟靜脈、膽管研究的較多,而對(duì)于肝臟淋巴管道系統(tǒng)研究較少,尤其是作為肝組織的回流系統(tǒng),在肝臟脂代謝及脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方面的作用,缺乏研究。
本實(shí)驗(yàn)分為三部分,通過腹部手術(shù)結(jié)扎新西蘭大白兔腹段胸導(dǎo)管,造成實(shí)驗(yàn)性肝淋巴瘀滯的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型;應(yīng)用光鏡和掃
2、面、透射電鏡,觀察正常和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化;利用酶聯(lián)免疫吸附法、共聚焦技術(shù),檢測(cè)肝臟載脂蛋白E和肝X因子受體的變化;探討肝淋巴瘀滯對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)和脂代謝的影響,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:
第一部分胸導(dǎo)管結(jié)扎誘發(fā)家兔肝淋巴瘀滯的形態(tài)學(xué)觀察
目的:在腹部手術(shù)結(jié)扎家兔胸導(dǎo)管,造成肝淋巴回流阻滯,觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔及肝臟脂肪堆積情況,觀察此種方式制造家兔肝淋巴瘀滯動(dòng)物模型的結(jié)果。
方法:(1)選用健康清潔級(jí)12
3、周齡新西蘭大白兔24只,體重1500-1800g,雄性,采用對(duì)照研究的方法,隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)(胸導(dǎo)管結(jié)扎)組14只和對(duì)照(假性手術(shù))組10只;(2)實(shí)驗(yàn)開始前1.5小時(shí),用食用大豆油10毫升經(jīng)灌胃針灌喂家兔,實(shí)驗(yàn)開始時(shí),首先用10%水合氯醛(2.4 ml/kg)經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈注射,深度麻醉,無菌操作,將乳糜池和腹段胸導(dǎo)管清楚的顯露,采用自左側(cè)腎上腺上方向上游離出新西蘭大白兔腹主動(dòng)脈1厘米,玻璃分離器將此段腹主動(dòng)脈挑起,4號(hào)縫線
4、將腹段胸導(dǎo)管連同其周圍的組織一起結(jié)扎。關(guān)閉腹腔前,腹腔注射慶大霉素5.0 mg/kg,生理鹽水20毫升。對(duì)照組只是充分游離胸導(dǎo)管而不結(jié)扎。(3)手術(shù)環(huán)境:操作室為清潔級(jí),手術(shù)臺(tái)清潔,手術(shù)操作過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則和無菌操作管理制度。(4)術(shù)后的新西蘭大白兔在潔凈的,室溫18-24℃,相對(duì)濕度60%的環(huán)境中分籠飼養(yǎng),12小時(shí)白天、12小時(shí)黑夜的生活周期,自由飲水,攝食200g/d(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的嚙齒類普通食物)。(5)
5、術(shù)后6個(gè)月,所有的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物,在10%水合氯醛(2.4ml/kg)經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈注射,深度麻醉下,同造模時(shí)無菌操作過程,開腹觀察新西蘭大白兔腹腔和肝臟脂肪堆積情況。
結(jié)果:
1.造模前:肝臟呈鮮紅色,質(zhì)地柔軟,邊緣銳利,表面光滑,腹腔脂肪較少,腸系膜清亮透明。造模后:(1)實(shí)驗(yàn)組:肝臟呈暗紅色,質(zhì)地粗糙,肝臟邊緣變圓頓,表面有油膩感,有輕度肝纖維化的感覺,肝臟表面裂隙變寬、變深,伴有肝被膜下脂肪沉積;腹腔
6、脂肪沉積明顯增多,腸系膜上可見明顯脂肪沉積,并且在腸系膜上可見成串的脂肪球或脂肪泡。(2)對(duì)照組:肝臟色澤依舊鮮紅,質(zhì)地依舊柔軟,邊緣依舊銳利,表而依舊光滑、細(xì)膩;腹腔未見脂肪沉積,腸系膜依舊清亮、透明。
2.HE染色石蠟切片光鏡下觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝小葉結(jié)構(gòu)完整:門管區(qū)的門靜脈、肝動(dòng)脈及膽管結(jié)構(gòu)完整、清晰,小葉中央靜脈完整、清晰;位于小葉中央靜脈與匯管區(qū)之間的肝細(xì)胞排列成索狀,肝細(xì)胞排列規(guī)律,無雜亂,肝血竇未見
7、異常,肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞內(nèi)無脂肪滴,無肝細(xì)胞疏松變性,未見到肝細(xì)胞壞死,肝被膜的扁平上皮細(xì)胞排列整齊,被膜下無細(xì)胞浸潤(rùn)。(2)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:肝小葉結(jié)構(gòu)依舊完整:門管區(qū)的門靜脈、肝動(dòng)脈及膽管結(jié)構(gòu)完整、清晰,但周圍有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)可見擴(kuò)張的淋巴管,小葉中央靜脈依舊完整、清晰;位于小葉中央靜脈與匯管區(qū)之間的肝細(xì)胞排列成索狀,肝細(xì)胞排列較規(guī)律,無雜亂,肝血竇略顯擴(kuò)張,肝細(xì)胞體積增大,肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪滴,可見肝細(xì)胞疏松變性,偶見到肝
8、細(xì)胞壞死,肝小葉內(nèi)含有脂肪的肝細(xì)胞數(shù)目明顯增多,而且越接近匯管區(qū)肝細(xì)胞脂肪變性越輕,小葉中央靜脈周圍也可見肝細(xì)胞脂肪變性,出現(xiàn)少量肝細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象,肝細(xì)胞周圍可見以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。越是接近肝小葉中央靜脈,肝細(xì)胞脂肪變性的程度越嚴(yán)重。未見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞及異常,未見假小葉??梢姼伍T管區(qū)輕度纖維化。覆蓋于肝組織的腹膜上皮扁平,扁平的上皮細(xì)胞排列不整齊,上皮下可見淋巴管擴(kuò)張。
3.造模前和造模6個(gè)月后體重的變化:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后
9、6個(gè)月健康成活8只,體重3000-3500g,平均體重3381.25g,實(shí)驗(yàn)前后體重平均增加1718.75±114.06g;對(duì)照組術(shù)后6個(gè)月健康成活8只,體重2500-3000g,平均體重2731.25g,實(shí)驗(yàn)前后體重平均增加1093.75±129.69g。造模前和造模6個(gè)月后體重的變化:實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎胸導(dǎo)管后體重明顯升高,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)
結(jié)論:采用手術(shù)結(jié)扎新西蘭大白兔胸導(dǎo)管腹段的方法,可以建立新
10、西蘭大白兔肝臟淋巴瘀滯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型;結(jié)扎新西蘭大白兔胸導(dǎo)管腹段造成肝臟淋巴瘀滯,肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積,肝細(xì)胞脂肪變性,肝臟脂肪變性,甚至輕度纖維化。
第二部分實(shí)驗(yàn)性肝淋巴瘀滯誘發(fā)肝組織細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)變化
目的:探討實(shí)驗(yàn)性肝淋巴瘀滯對(duì)新西蘭大白兔肝細(xì)胞和肝被膜扁平細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。
方法:實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔選擇、飼養(yǎng)、造模等方法同上。術(shù)后6個(gè)月,所有的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物,在10%水合氯醛(2.4ml/kg)經(jīng)新西蘭
11、大白兔耳緣靜脈注射,深度麻醉下,同造模時(shí)無菌操作過程,開腹:切取臨近鐮狀韌帶的小塊肝臟組織,用生理鹽水、2.5%戊二醛0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)依次洗滌,放入2.5%戊二醛0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)保存,備掃描電鏡用;切取臨近肝表面的小塊肝臟組織,用生理鹽水、4%戊二醛0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)依次洗滌,放入4%戊二醛0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)保存,備透射電鏡用。
結(jié)果:
1.HE染
12、色石蠟切片光鏡下觀察:同前。
2.肝組織表面掃描電子顯微鏡觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝被膜表面扁平的上皮細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)規(guī)整,扁平上皮細(xì)胞表面光滑,其微絨毛主要分布于扁平上皮細(xì)胞的邊緣,扁平上皮細(xì)胞之間的間隙清晰可見,其間微絨毛稀疏,統(tǒng)計(jì)三張5000倍掃面電鏡下,每張20個(gè)較為清晰的扁平上皮細(xì)胞之間的間隙,計(jì)算扁平上皮細(xì)胞之間的間隙大小為1.17um;肝被膜表面的腹膜孔清晰可見,腹膜孔存在于三個(gè)相鄰上皮細(xì)胞之間,其
13、表面可見少量吞噬細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)三張5000倍掃面電鏡下,每張20個(gè)較為清晰的扁平上皮細(xì)胞之間的腹膜孔,計(jì)算扁平上皮細(xì)胞之間的腹膜孔大小為2.79um。(2)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:肝被膜表面扁平上皮細(xì)胞排列較規(guī)整,細(xì)胞略呈扁橢圓形,主要存在于扁平上皮細(xì)胞邊緣的微絨毛增多、變長(zhǎng),原本光滑的扁平上皮細(xì)胞表面也覆蓋了大量的微絨毛;整個(gè)扁平上皮細(xì)胞的微絨毛數(shù)量呈現(xiàn)增多,不但密布于扁平上皮細(xì)胞之間的間隙,還分布于扁平上皮細(xì)胞的表面,致使扁平上皮細(xì)胞之間的
14、間隙變得不甚清晰;扁平上皮細(xì)胞之間的間隙變寬,同樣的方法計(jì)算間隙大小為2.08um,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肝被膜表面的腹膜孔清晰可見,存在于三個(gè)相鄰上皮細(xì)胞之間,同樣的方法計(jì)算腹膜孔大小為3.98um,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其表面的吞噬細(xì)胞數(shù)量多,腹膜孔周圍可見直徑約5-7 um的球形小泡,表面有棘狀突起及微絨毛,另外,肝被膜表面可見大量直徑約1 um的小泡。
3.肝組織超薄切片
15、透射電子顯微鏡觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整、清晰,胞漿豐富,胞漿內(nèi)富含各種細(xì)胞器,肝細(xì)胞核居中或略偏,細(xì)胞核呈圓形,細(xì)胞核大,細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)均勻分布,異染色質(zhì)很少,核仁清晰,核膜完整、清晰,核膜孔清晰,核膜外的高爾基復(fù)合體結(jié)構(gòu)完整、清晰,胞漿可見豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,線粒體呈桿狀、球形,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈管、泡狀分布于胞漿各處,細(xì)胞漿內(nèi)含有大量的深色的梅花樣的糖原顆粒,細(xì)胞漿未見脂滴。細(xì)胞漿內(nèi)有少量的、深色的、體積大小不一
16、的球形溶酶體,散在分布于胞漿各處。肝血竇結(jié)構(gòu)正常,血竇旁可見Kuffer細(xì)胞,肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間的內(nèi)皮間孔未見異常增寬,Kuffer細(xì)胞呈不規(guī)則形狀,細(xì)胞核位于一側(cè),細(xì)胞核呈不規(guī)則形,核內(nèi)染色質(zhì)小均勻,較多異染色質(zhì),Kuffer細(xì)胞胞漿內(nèi)含有大量的、深色的、大小不一、球形的溶酶體。位于肝血竇周圍的間質(zhì)間隙未見增寬,可見少量膠原纖維,肝細(xì)胞的竇周間隙面可見較多微絨毛。肝細(xì)胞間可見毛細(xì)膽管,毛細(xì)膽管內(nèi)無瘀膽。兩個(gè)肝細(xì)胞間的間隙未見異常。(2)
17、實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:與對(duì)照組相比,肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)有異常改變,最明顯的是肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的脂肪滴,脂肪滴呈大小較均勻的、白色的球形,位于胞漿內(nèi),肝細(xì)胞核也出現(xiàn)異常改變,肝細(xì)胞核核膜間隙增寬,細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量深色的異染色質(zhì)團(tuán)塊,深色的異染色質(zhì)團(tuán)塊位于核膜下,出現(xiàn)的染色質(zhì)邊集;胞質(zhì)內(nèi)未見深色的梅花樣的糖原顆粒;可見雙核肝細(xì)胞。肝細(xì)胞旁的間隙及竇周間隙增寬,竇周間隙內(nèi)可見儲(chǔ)脂細(xì)胞,細(xì)胞核呈不規(guī)則形狀,核內(nèi)染色質(zhì)不均勻,較多異染色質(zhì),成堆的脂
18、肪滴位于細(xì)胞核旁,細(xì)胞核被推移到細(xì)胞的一側(cè),胞漿內(nèi)可見含有電子密度致密的核心的分泌顆粒。肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間孔變寬。肝細(xì)胞間間隙增寬。竇周間隙及肝細(xì)胞周圍間質(zhì)間隙內(nèi)膠原纖維明顯增多。肝細(xì)胞間毛細(xì)膽管內(nèi)瘀膽。
結(jié)論:肝臟淋巴瘀滯,導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積,肝細(xì)胞脂肪變性,匯管區(qū)纖維化;肝小葉淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);肝臟淋巴瘀滯,導(dǎo)致肝被膜扁平上皮細(xì)胞的微絨毛增多、變長(zhǎng),扁平上皮細(xì)胞之間的間隙變寬,存在于三個(gè)相鄰上皮細(xì)胞之間的腹膜孔也變寬,肝被膜表
19、面可見大量直徑約1 um的小泡,并出現(xiàn)淋巴樣細(xì)胞。
第三部分肝淋巴瘀滯誘發(fā)肝組織載脂蛋白E和肝X因子受體的變化
目的:探討實(shí)驗(yàn)性淋巴瘀滯對(duì)肝脂代謝的影響以及可能的機(jī)制。
方法:實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔選擇、飼養(yǎng)、造模等方法同上。術(shù)后6個(gè)月,所有的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物,在10%水合氯醛(2.4ml/kg)經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈注射,深度麻醉下,同造模時(shí)無菌操作過程,開腹:切取1.0×1.0×1.0cm大小的肝臟組織,用生
20、理鹽水、4%多聚甲醛依次洗滌,放入4%多聚甲醛,備HE染色、免疫組化檢查用。肝后下腔靜脈取血5ml,經(jīng)3000 r/min離心10 min分離血清,取上清再經(jīng)濾紙濾過后,-70℃保存。
結(jié)果:
1.血清血脂四項(xiàng)結(jié)果:通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組新西蘭大白兔血清膽固醇、游離脂肪酸、甘油三酯和極低密度脂蛋白的水平進(jìn)行檢測(cè)和分析,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔血清中游離脂肪酸、甘油三酯以及極低密度脂蛋白水平升高,較對(duì)照組有明顯,差異具
21、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但是,兩組新西蘭大白兔的血清膽固醇水平差異不明顯,兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.HE染色石蠟切片光鏡下觀察:同前。
3.免疫熒光化學(xué)染色、激光共聚焦顯微鏡觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝組織免疫熒光強(qiáng)度清晰,集中趨勢(shì)明顯,代表載脂蛋白E的綠色熒光主要集中在匯管區(qū),與代表肝X受體的紅色熒光集中區(qū)域一致,雙通道結(jié)果顯示,兩者染色重合的黃色區(qū)域并不多,主要集中于匯管區(qū)。選取典
22、型區(qū)域3個(gè),圍繞匯管區(qū)劃線,統(tǒng)計(jì)免疫熒光強(qiáng)度,對(duì)照組代表載脂蛋白E的綠色熒光強(qiáng)度為67.31±12.23 AU,代表肝X受體的紅色熒光強(qiáng)度為191.17±35.69AU。(2)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:肝組織免疫熒光強(qiáng)度弱,明顯低于對(duì)照組,集中趨勢(shì)與對(duì)照組一致。免疫熒光強(qiáng)度分析,不論代表載脂蛋白E的綠色熒光,還是代表肝X受體的紅色熒光,強(qiáng)度均較對(duì)照組減弱。選取典型區(qū)域3個(gè),圍繞匯管區(qū)劃線,統(tǒng)計(jì)免疫熒光強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)組代表載脂蛋白E的綠色熒光強(qiáng)度為
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