EBNA1穩(wěn)定鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)EB病毒基因組作用的初步探討.pdf

1、鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤，絕大部份為低分化或未分化型鱗癌，惡性度較高，生長(zhǎng)快，易出現(xiàn)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因而傳統(tǒng)的局部放射治療很難提高晚期鼻咽癌病人的生存率。 經(jīng)過(guò)多年的病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有病人的未分化型鼻咽癌組織中均存在Epstein-Barr病毒(EBV)基因組，這種鼻咽癌細(xì)胞為EBV陽(yáng)性的特征為鼻咽癌的基因治療提供了靶點(diǎn)。然而，目前國(guó)內(nèi)外已建立的鼻咽癌細(xì)胞系還沒(méi)有病毒潛伏感染并穩(wěn)定存在的細(xì)胞模型。因此，建立穩(wěn)

2、定感染EBV的鼻咽癌細(xì)胞株是打破研究瓶頸的重要前提。 目的：本研究通過(guò)探討EBV的轉(zhuǎn)錄因子EBNA1在維持病毒基因組穩(wěn)定中的作用，建立EBV穩(wěn)定感染的鼻咽癌細(xì)胞模型，從而為鼻咽癌的基因治療及臨床前研究奠定基礎(chǔ)。 方法：1.通過(guò)共培養(yǎng)法使CNE1或CNE2細(xì)胞感染EBV攜有EBV的B95-8細(xì)胞與CNE1或CNE2細(xì)胞接觸共培養(yǎng)24小時(shí)，使其感染EBV。 2.抗體激活補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以去除B95-8細(xì)胞根據(jù)抗

3、體激活補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性原理，采用抗IgM抗體和新鮮兔血清選擇性地去除共培養(yǎng)系中的B95-8細(xì)胞。 3.檢測(cè)B95-8細(xì)胞的去除效果，同時(shí)驗(yàn)證CNEB細(xì)胞內(nèi)的EBV的存在以去除B95-8的感染后細(xì)胞的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增B95-8特異的CAJA-DRBI片斷，檢測(cè)是否徹底去除B95-8細(xì)胞。將感染后的CNE1、CNE2細(xì)胞分別命名為CNEB1、CNEB2。以CNEB1和CNEB2細(xì)胞的基因組DNA為模板擴(kuò)增EBV的Ba

4、mHI-W基因，在基因組水平上檢測(cè)細(xì)胞中EBV的存在。通過(guò)RT-PCR及SouthernHybridize雜交的方法檢測(cè)CNEB2細(xì)胞中的EBV潛伏期的EBER和裂解期的BZLF-1的轉(zhuǎn)錄。 4.EBNA1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及WesternBlot檢測(cè) PCR擴(kuò)增EBV的EBNA1LR1和LR2-DNA結(jié)合區(qū)兩段功能片斷，先后連于真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-his(+)C，完成EBNA1真核表達(dá)載體的構(gòu)建，將其

5、命名為P-T-EBNA。將P-T-EBNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)EBNA1的表達(dá)。 5.P-T-EBNA穩(wěn)定EBV基因組的功能鑒定在感染后第九天的CNEB2細(xì)胞轉(zhuǎn)染P-T-EBNA及空載體，通過(guò)檢測(cè)EBER的轉(zhuǎn)錄持續(xù)期間，驗(yàn)證P-T-EBNA具有穩(wěn)定EBV基因組于鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)的功能。 結(jié)果：1.形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)CNEB1和CNEB2細(xì)胞形態(tài)有所改變，由多邊形變成梭形，一些細(xì)胞內(nèi)有許多空泡生成，貼

6、附能力明顯減弱。 2.對(duì)CNEB2細(xì)胞的CAJA-DRBI基因的檢測(cè)結(jié)果為陰性，證明抗體激活補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行コ鼴95-8細(xì)胞。 3.在DNA水平檢測(cè)到了BamHI-W基因，證明CNEB2細(xì)胞內(nèi)存在EBV基因，在RNA水平檢測(cè)到BZLF-1轉(zhuǎn)錄持續(xù)12天，EBER轉(zhuǎn)錄持續(xù)14天。通過(guò)SouthernHybridize雜交的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了BZLF-1的轉(zhuǎn)錄。 4.成功構(gòu)建了EBNA1真核表達(dá)載體P-T

7、-EBNA，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)到目的基因EBNA1可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。 5.轉(zhuǎn)染P-T-EBNA的CNEB2細(xì)胞內(nèi)EBV基因持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組。 結(jié)論：本研究通過(guò)建立EBV陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞模型，主要得出以下結(jié)論： 1.鼻咽癌細(xì)胞與B95-8細(xì)胞接觸共培養(yǎng)的方法是鼻咽癌細(xì)胞感染EBV的有效途徑。 2.與CNE1相比CNE2的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境更適合EBV的潛伏感染。 3.抗體激活補(bǔ)體依賴(lài)的