集落刺激因子-1受體在鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗中的作用的初步探討.pdf

1、背景及目的:本課題組通過前期DNA芯片對鼻咽癌放療抵抗型病人和放療敏感型病人組織進(jìn)行基因表達(dá)譜比較，其中差異倍數(shù)最大的是集落刺激因子-1受體(Colony stimulaiting factor1 receptor，CSF-1R)，它在放療抵抗型病人組織中上調(diào)表達(dá)，在放療敏感型病人組織中下調(diào)表達(dá)，其可能是放療抵抗的一個(gè)關(guān)鍵分子，但CSF-1R在鼻咽癌放療抵抗中的機(jī)制尚不明確。本課題組在對臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)的探究以及免疫組織化學(xué)方法分析CSF-

2、1R在鼻咽癌和鼻咽炎中的差異表達(dá)的基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-TimeQuantitative Polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western Blot從鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B和CNE-2中篩選出CSF-1R高表達(dá)(CSF-1R+)細(xì)胞株5-8F和CSF-1R低表達(dá)（CSF-1R-）細(xì)胞株6-10B。進(jìn)一步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面探討鼻咽癌CSF-1R+細(xì)胞株和CSF-1R-

3、細(xì)胞株之間以及在接受X線照射前后增殖能力和凋亡情況的變化。以期尋找鼻咽癌患者的治療新靶點(diǎn)，同時(shí)能為鼻咽癌的治療及預(yù)后找到一個(gè)新的預(yù)測指標(biāo)。
　　方法:
　　1.采用6-MV X線直線加速器按0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的劑量分為5組，分別照射CSF-1 R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)胞株6-10B，照射后分別繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞。
　　2.采用CCK-8法來檢測CSF-1R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)

4、胞株6-10B的增殖能力，以及檢測接受不同劑量照射前后的5-8F細(xì)胞株和6-10B細(xì)胞株的增殖能力之間的差異。
　　3.采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CSF-1R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)胞株6-10B的增殖能力，以及檢測接受不同照射劑量前后的5-8F細(xì)胞株和6-10B細(xì)胞株的增殖能力的差異。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CSF-1R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)胞株6-10B的凋亡情況，以及檢測接受不同照射劑量前后的5-8

5、F細(xì)胞株和6-10B細(xì)胞株的凋亡之間的差異。
　　5.采用RT-PCR檢測CSF-1R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)胞株6-10B，以及檢測接受不同照射劑量前后的5-8F細(xì)胞株和6-10B細(xì)胞株的P53，F(xiàn)asL的表達(dá)水平。
　　6.通過RNA過表達(dá)技術(shù)構(gòu)建6-10B細(xì)胞株CSF-1R過表達(dá)慢病毒載體。
　　結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)分別檢測5-8F細(xì)胞株(CSF-1R+)和6-10B細(xì)胞株(CSF-1R-)細(xì)

6、胞增殖、凋亡能力的差異:
　　1.1 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞株5-8F增殖能力高于細(xì)胞株6-10B(P＜0.05)
　　1.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞株5-8F增殖能力高于細(xì)胞株6-10B(P＜0.05)
　　1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡情況，表明兩種細(xì)胞的凋亡是有差異的，5-8F細(xì)胞的凋亡高于6-10B細(xì)胞，差異明顯。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)檢測接受X線照射后5-8F細(xì)胞株(CSF-1R+)和6-10B細(xì)胞株(CSF

7、-1R-)（收集不同劑量點(diǎn)和不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞）增殖、凋亡能力的變化:
　　2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)表明:和陰性對照組比較，在培養(yǎng)36小時(shí)后，2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后的5-8F細(xì)胞增殖情況存在顯著差異（F=1.639，P＜0.01），6-10B細(xì)胞株2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后增殖情況存在差異，但差異比5-8F小(F=0.928，P＜0.05)。和陰性對照組比較，在培養(yǎng)48小時(shí)后，2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后的5-8F

8、細(xì)胞增殖情況存在顯著差異（F=1.548，P＜0.01），6-10B細(xì)胞株2Gy、4Gy、6Gy劑量照射后增殖情況存在明顯差異，(F=9.622，P＜0.01)。
　　2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:各組均有細(xì)胞集落形成，但數(shù)目和大小均存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞株5-8F的克隆計(jì)數(shù)要比細(xì)胞株6-10B的克隆計(jì)數(shù)要高(P＜0.05)。集落的數(shù)目和X線照射的劑量成反比。
　　2.3 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:5-8F細(xì)胞株凋亡高于6

9、-10B細(xì)胞株。
　　3.采用RT-PCR從基因水平檢測CSF-1R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)胞株6-10B增殖和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況:
　　3.1 增殖相關(guān)因子P53在CSF-1R+細(xì)胞株5-8F和CSF-1R-細(xì)胞株6-10B中的表達(dá)未見明顯差異(P＞0.05);
　　3.2 凋亡相關(guān)因子FasL在5-8F細(xì)胞株(CSF-1R+)和6-10B細(xì)胞株(CSF-1R-)中的表達(dá)并未見明顯差異(P＞0.05);

10、
　　3.3 在細(xì)胞接受2Gy X射線照射后，增殖相關(guān)因子P53的mRNA表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但細(xì)胞株5-8F細(xì)胞P53表達(dá)增高大于6-10B細(xì)胞株;
　　3.4 細(xì)胞株5-8F接受X線照射2Gy和未接受X線照射的FasL的mRNA的表達(dá)水平之間存在差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);細(xì)胞株6-10B接受X線照射2Gy和未接受X線照射中FasL的mRNA的表達(dá)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

11、5);接受2Gy照射的5-8F細(xì)胞株中FasL的mRNA的表達(dá)水平低于和6-10B細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這表明，接受2Gy照射后5-8F的FasL表達(dá)水平的降低高于6-10B，CSF-1R的表達(dá)和細(xì)胞的放射抵抗性是呈正相關(guān)的。
　　4.成功構(gòu)建CSF-1R過表達(dá)的慢病毒載體。用于下一步研究CSF-1R陰性細(xì)胞株轉(zhuǎn)染CSF-1R過表達(dá)慢病毒載體后細(xì)胞功能的變化。
　　結(jié)論:
　　1.不同鼻咽癌細(xì)胞株的