EB病毒潛伏膜蛋白LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章鼻咽癌細(xì)胞中LMP1的表達(dá)與其對(duì)TRAIL敏感性的關(guān)系
　　 目的:有研究表明不同鼻咽癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性不同，因此本章我們檢測(cè)對(duì)比不同鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒潛伏膜蛋白LMP1表達(dá)水平和其對(duì)TRAIL的敏感性，并探討兩者之間的關(guān)系。方法:采用MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種不同鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1、CNE-2、C666-1對(duì)不同濃度及不同作用時(shí)相TRAIL處理的敏感度;另外，運(yùn)用RT-PCR及Western blot檢測(cè)L

2、MP1 mRNA及蛋白在三種鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:TRAIL對(duì)三種鼻咽癌細(xì)胞起生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，CNE-1對(duì)TRAIL的敏感性最高，而C666-1對(duì)TRAIL的敏感性最低。CNE-1、CNE-2、C666-1細(xì)胞LMP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.02、0.52±0.02、1.44±0.12，LMP1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.02、0.49±0.02、0.95±0.06。CNE-1細(xì)胞LMP

3、1mRNA及蛋白表達(dá)量最低，而C666-1細(xì)胞LMP1mRNA及蛋白表達(dá)量最高。
　　 結(jié)論:TRAIL能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，但不同鼻咽癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性與LMP1表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，LMP1表達(dá)越高，對(duì)TRAIL的敏感性就越低。提示LMP1是影響TRAIL敏感性的抗凋亡因子。
　　 第二章 LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗的體外實(shí)驗(yàn)
　　 目的:研究表明LMP1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，且

4、上一部分實(shí)驗(yàn)表明不同鼻咽癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性與LMP1表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。因此，該部分我們上調(diào)LMP1在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察LMP1基因過表達(dá)后對(duì)TRAIL凋亡誘導(dǎo)作用和凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的影響。
　　 方法:利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的pGL6-LMP1上調(diào)LMP1低表達(dá)的TRAIL抵抗性鼻咽癌細(xì)胞CNE-1中LMP1的表達(dá)，熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;G418篩選LMP1基因穩(wěn)定表達(dá)的CNE-1細(xì)胞，RT-PCR及westernblot技

5、術(shù)檢測(cè)LMP1基因的過表達(dá)效果;通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)觀察LMP1過表達(dá)后對(duì)CNE-1細(xì)胞TRAIL敏感性的影響;流式細(xì)胞術(shù)、western blot、線粒體膜電位檢測(cè)觀察LMP1過表達(dá)后對(duì)死亡受體表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)外凋亡信號(hào)通路激活、線粒體膜電位改變的影響。
　　 結(jié)果:脂質(zhì)體介導(dǎo)的pGL6-LMP1成功上調(diào)了CNE-1細(xì)胞中LMP1的表達(dá)，構(gòu)建LMP1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞CNE-1-LMP1。CNE-1、轉(zhuǎn)染空白質(zhì)細(xì)胞CNE-1-pGL

6、6、CNE-1-LMP1中LMP1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為，LMP1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.01、0.22±0.01、0.69±0.01。與CNE-1及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)細(xì)胞CNE-1-pGL6比較，TRAIL對(duì)CNE-1-LMP1的細(xì)胞殺傷作用和凋亡誘導(dǎo)作用明顯減弱。死亡受體熒光標(biāo)記后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CNE-1和CNE-1-LMP1之間細(xì)胞膜蛋白DR4、DR5表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Western blot結(jié)果顯示TRA

7、IL(100ng/ml)分別作用2、4、6、12小時(shí)后，CNE-1細(xì)胞中caspase-8 p43/p41，p18亞單位蛋白和caspase-3 p17，p10亞單位蛋白表達(dá)明顯高于CNE-1-LMP1細(xì)胞，而tBid和caspase-9 p35亞單位蛋白表達(dá)無明顯改變，且兩個(gè)細(xì)胞株間也無明顯區(qū)別。JC-1線粒體膜電位檢測(cè)法結(jié)果顯示TRAIL干預(yù)后，線粒體膜電位無明顯改變，且兩個(gè)細(xì)胞株間也無明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:LMP1過表達(dá)

8、抑制TRAIL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和其細(xì)胞外凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，提示LMP1是通過抑制細(xì)胞外信號(hào)通路激活誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗。
　　 第三章 LMP1通過激活PI3K/Akt通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗
　　 目的:研究表明PI3K/Akt通路活化是細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗的重要機(jī)制，因此本部分從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞中LMP1過表達(dá)可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，并進(jìn)一步驗(yàn)證LMP1是通過PI3K

9、/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗。
　　 方法:運(yùn)用western blot檢測(cè)LMP1過表達(dá)后Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表達(dá)改變;免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)LMP1過表達(dá)后LMP1和p-Akt的共定位。選用PI3K特異性抑制劑LY294002抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CNE-1、CNE-1-LMP1對(duì)TRAIL敏感性的改變;Western blot檢測(cè)細(xì)胞外信號(hào)通路的激活情況。

10、r>　　 結(jié)果:CNE-1-LMP1細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)明顯高于CNE-1細(xì)胞。免疫熒光雙標(biāo)記顯示與LMP1過表達(dá)后，p-Akt表達(dá)增高，且出現(xiàn)由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位，與LMP1共定位于細(xì)胞膜上。1μmol/ml LY294002預(yù)處理8小時(shí)后的CNE-1和CNE-1-LMP1中p-Akt表達(dá)明顯降低，且兩細(xì)胞間p-Akt表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。MTT及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LY294002預(yù)處理后，CNE-1、CNE-1-LMP1

11、對(duì)TRAIL的敏感性明顯提高，且兩細(xì)胞間無明顯差異。Western blot結(jié)果顯示TRAIL(100ng/ml)分別作用2、4、6、12小時(shí)后，LY294002預(yù)處理后的CNE-1-LMP1細(xì)胞中caspase-8 p43/p41，p18亞單位蛋白和caspase-3p17，p10亞單位蛋白表達(dá)明顯高于未經(jīng)LY294002預(yù)處理的CNE-1-LMP1細(xì)胞。
　　 結(jié)論:LMP1是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)

12、生TRAIL抵抗，提示針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的鼻咽癌靶向治療方案可能逆轉(zhuǎn)LMP1誘導(dǎo)的TRAIL抵抗
　　 第四章 LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌發(fā)生TRAIL抵抗在的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:進(jìn)一步從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并利用所獲得的移植瘤組織標(biāo)本對(duì)LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生TRAIL抵抗的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法:采用CNE-1和CNE-1-LMP1細(xì)胞構(gòu)建LMP1不同表達(dá)水平的鼻咽癌動(dòng)物移植

13、瘤模型，并進(jìn)行TRAIL干預(yù)。通過測(cè)量瘤體大小、HE染色驗(yàn)證其成瘤及瘤體生長情況;Western blot技術(shù)檢測(cè)移植瘤標(biāo)本中LMP1的表達(dá)情況;TUNEL熒光凋亡檢測(cè)法檢測(cè)瘤體中凋亡細(xì)胞量;計(jì)算對(duì)比TRAIL對(duì)兩種細(xì)胞腫瘤的生長抑制率。
　　 結(jié)果:采用CNE-1和CNE-1-LMP1細(xì)胞成功構(gòu)建LMP1高表達(dá)及低表達(dá)鼻咽癌動(dòng)物移植瘤模型，HE染色證實(shí)成瘤率達(dá)100％，westernblot檢測(cè)顯示CNE-1-LMP1細(xì)胞移植

14、瘤LMP1蛋白表達(dá)高于CNE-1細(xì)胞移植瘤。CNE-1對(duì)照組移植瘤和CNE-1-LMP1對(duì)照組移植瘤在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積、處死裸鼠后腫瘤重量、TUNEL熒光凋亡檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TRAIL干預(yù)組移植瘤在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積、處死裸鼠后腫瘤重量均低于對(duì)應(yīng)對(duì)照組移植瘤，而TUNEL熒光凋亡檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)高于對(duì)應(yīng)對(duì)照組移植瘤。CNE-1 TRAIL干預(yù)組移植瘤在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積、處死裸鼠后腫瘤重量均低于CNE-1-LMP