EB病毒潛伏膜蛋白LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生TRAIL抵抗的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、第一章鼻咽癌細胞中LMP1的表達與其對TRAIL敏感性的關(guān)系
　　 目的:有研究表明不同鼻咽癌細胞對TRAIL的敏感性不同，因此本章我們檢測對比不同鼻咽癌細胞中EB病毒潛伏膜蛋白LMP1表達水平和其對TRAIL的敏感性，并探討兩者之間的關(guān)系。方法:采用MTT和流式細胞術(shù)檢測三種不同鼻咽癌細胞株CNE-1、CNE-2、C666-1對不同濃度及不同作用時相TRAIL處理的敏感度;另外，運用RT-PCR及Western blot檢測L

2、MP1 mRNA及蛋白在三種鼻咽癌細胞中的表達。
　　 結(jié)果:TRAIL對三種鼻咽癌細胞起生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，CNE-1對TRAIL的敏感性最高，而C666-1對TRAIL的敏感性最低。CNE-1、CNE-2、C666-1細胞LMP1 mRNA相對表達量分別為0.27±0.02、0.52±0.02、1.44±0.12，LMP1蛋白相對表達量分別為0.29±0.02、0.49±0.02、0.95±0.06。CNE-1細胞LMP

3、1mRNA及蛋白表達量最低，而C666-1細胞LMP1mRNA及蛋白表達量最高。
　　 結(jié)論:TRAIL能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡，但不同鼻咽癌細胞對TRAIL的敏感性與LMP1表達存在負相關(guān)，LMP1表達越高，對TRAIL的敏感性就越低。提示LMP1是影響TRAIL敏感性的抗凋亡因子。
　　 第二章 LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生TRAIL抵抗的體外實驗
　　 目的:研究表明LMP1對鼻咽癌細胞凋亡具有調(diào)控作用，且

4、上一部分實驗表明不同鼻咽癌細胞對TRAIL的敏感性與LMP1表達存在負相關(guān)。因此，該部分我們上調(diào)LMP1在鼻咽癌細胞中的表達，并觀察LMP1基因過表達后對TRAIL凋亡誘導(dǎo)作用和凋亡信號傳導(dǎo)的影響。
　　 方法:利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的pGL6-LMP1上調(diào)LMP1低表達的TRAIL抵抗性鼻咽癌細胞CNE-1中LMP1的表達，熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率;G418篩選LMP1基因穩(wěn)定表達的CNE-1細胞，RT-PCR及westernblot技

5、術(shù)檢測LMP1基因的過表達效果;通過MTT法、流式細胞術(shù)觀察LMP1過表達后對CNE-1細胞TRAIL敏感性的影響;流式細胞術(shù)、western blot、線粒體膜電位檢測觀察LMP1過表達后對死亡受體表達、細胞內(nèi)外凋亡信號通路激活、線粒體膜電位改變的影響。
　　 結(jié)果:脂質(zhì)體介導(dǎo)的pGL6-LMP1成功上調(diào)了CNE-1細胞中LMP1的表達，構(gòu)建LMP1穩(wěn)定表達細胞CNE-1-LMP1。CNE-1、轉(zhuǎn)染空白質(zhì)細胞CNE-1-pGL

6、6、CNE-1-LMP1中LMP1mRNA相對表達量分別為，LMP1蛋白相對表達量分別為0.23±0.01、0.22±0.01、0.69±0.01。與CNE-1及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)細胞CNE-1-pGL6比較，TRAIL對CNE-1-LMP1的細胞殺傷作用和凋亡誘導(dǎo)作用明顯減弱。死亡受體熒光標(biāo)記后流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CNE-1和CNE-1-LMP1之間細胞膜蛋白DR4、DR5表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。Western blot結(jié)果顯示TRA

7、IL(100ng/ml)分別作用2、4、6、12小時后，CNE-1細胞中caspase-8 p43/p41，p18亞單位蛋白和caspase-3 p17，p10亞單位蛋白表達明顯高于CNE-1-LMP1細胞，而tBid和caspase-9 p35亞單位蛋白表達無明顯改變，且兩個細胞株間也無明顯區(qū)別。JC-1線粒體膜電位檢測法結(jié)果顯示TRAIL干預(yù)后，線粒體膜電位無明顯改變，且兩個細胞株間也無明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:LMP1過表達

8、抑制TRAIL對鼻咽癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用和其細胞外凋亡信號的傳導(dǎo)，提示LMP1是通過抑制細胞外信號通路激活誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生TRAIL抵抗。
　　 第三章 LMP1通過激活PI3K/Akt通路誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生TRAIL抵抗
　　 目的:研究表明PI3K/Akt通路活化是細胞發(fā)生TRAIL抵抗的重要機制，因此本部分從體外實驗證實鼻咽癌細胞中LMP1過表達可以激活PI3K/Akt信號通路，并進一步驗證LMP1是通過PI3K

9、/Akt信號通路誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生TRAIL抵抗。
　　 方法:運用western blot檢測LMP1過表達后Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表達改變;免疫熒光雙標(biāo)記檢測LMP1過表達后LMP1和p-Akt的共定位。選用PI3K特異性抑制劑LY294002抑制PI3K/Akt信號通路后，MTT及流式細胞術(shù)檢測CNE-1、CNE-1-LMP1對TRAIL敏感性的改變;Western blot檢測細胞外信號通路的激活情況。

10、r>　　 結(jié)果:CNE-1-LMP1細胞p-Akt蛋白表達明顯高于CNE-1細胞。免疫熒光雙標(biāo)記顯示與LMP1過表達后，p-Akt表達增高，且出現(xiàn)由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位，與LMP1共定位于細胞膜上。1μmol/ml LY294002預(yù)處理8小時后的CNE-1和CNE-1-LMP1中p-Akt表達明顯降低，且兩細胞間p-Akt表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。MTT及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示LY294002預(yù)處理后，CNE-1、CNE-1-LMP1

11、對TRAIL的敏感性明顯提高，且兩細胞間無明顯差異。Western blot結(jié)果顯示TRAIL(100ng/ml)分別作用2、4、6、12小時后，LY294002預(yù)處理后的CNE-1-LMP1細胞中caspase-8 p43/p41，p18亞單位蛋白和caspase-3p17，p10亞單位蛋白表達明顯高于未經(jīng)LY294002預(yù)處理的CNE-1-LMP1細胞。
　　 結(jié)論:LMP1是通過激活PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)

12、生TRAIL抵抗，提示針對PI3K/Akt信號通路的鼻咽癌靶向治療方案可能逆轉(zhuǎn)LMP1誘導(dǎo)的TRAIL抵抗
　　 第四章 LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌發(fā)生TRAIL抵抗在的體內(nèi)實驗研究
　　 目的:進一步從體內(nèi)實驗證實細胞水平的實驗結(jié)果，并利用所獲得的移植瘤組織標(biāo)本對LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌細胞發(fā)生TRAIL抵抗的作用機制進行初步探討。
　　 方法:采用CNE-1和CNE-1-LMP1細胞構(gòu)建LMP1不同表達水平的鼻咽癌動物移植

13、瘤模型，并進行TRAIL干預(yù)。通過測量瘤體大小、HE染色驗證其成瘤及瘤體生長情況;Western blot技術(shù)檢測移植瘤標(biāo)本中LMP1的表達情況;TUNEL熒光凋亡檢測法檢測瘤體中凋亡細胞量;計算對比TRAIL對兩種細胞腫瘤的生長抑制率。
　　 結(jié)果:采用CNE-1和CNE-1-LMP1細胞成功構(gòu)建LMP1高表達及低表達鼻咽癌動物移植瘤模型，HE染色證實成瘤率達100％，westernblot檢測顯示CNE-1-LMP1細胞移植

14、瘤LMP1蛋白表達高于CNE-1細胞移植瘤。CNE-1對照組移植瘤和CNE-1-LMP1對照組移植瘤在各個時間點腫瘤體積、處死裸鼠后腫瘤重量、TUNEL熒光凋亡檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。TRAIL干預(yù)組移植瘤在各個時間點腫瘤體積、處死裸鼠后腫瘤重量均低于對應(yīng)對照組移植瘤，而TUNEL熒光凋亡檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)高于對應(yīng)對照組移植瘤。CNE-1 TRAIL干預(yù)組移植瘤在各個時間點腫瘤體積、處死裸鼠后腫瘤重量均低于CNE-1-LMP