利用深度測(cè)序技術(shù)篩選膀胱癌突變基因及對(duì)HECW1基因突變的驗(yàn)證.pdf

1、目的:利用外顯子組深度測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)和篩選膀胱移行細(xì)胞癌(Transitional Cell Carcinoma Of Bladder,TCCB)中的致病候選基因,并通過Sanger測(cè)序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,為膀胱癌病因?qū)W研究提供一定的理論依據(jù),并探尋理想的腫瘤診斷標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　第一部分,取蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年4月手術(shù)治療的4例膀胱移行細(xì)胞癌患者癌及癌旁組織,其中2例為非肌層浸潤(rùn)性(非浸潤(rùn)組),2

2、例為肌層浸潤(rùn)性(浸潤(rùn)組)。采用SOLID深度基因測(cè)序的方法進(jìn)行全外顯子組測(cè)序,尋找突變基因,并通過特定的篩選條件進(jìn)行過濾,選出其中發(fā)生錯(cuò)義突變的基因。
　　第二部分,取蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供的2011年9月至2012年9月膀胱移行細(xì)胞癌術(shù)后臘片標(biāo)本84例,其中浸潤(rùn)性54例,非浸潤(rùn)性30例,及2013年3月至5月本院手術(shù)治療的膀胱移行細(xì)胞癌患者腫瘤組織15例,其中浸潤(rùn)性7例,非浸潤(rùn)性8例和10例癌旁組織作為對(duì)照,將此25例組

3、織制作成蠟塊。使用OMEGA試劑盒法提取癌及癌旁組織中基因組DNA,經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴(kuò)增后,應(yīng)用Sanger測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證深度測(cè)序中的突變結(jié)果。取制作的25例蠟塊,采用免疫組化Envision二步法,觀察HECW1蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　第一部分:深度測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量滿意,發(fā)現(xiàn)眾多突變基因,篩選出其中10個(gè)出現(xiàn)錯(cuò)義突變的基因,其中非浸潤(rùn)組

4、4個(gè),為IVL,RGPD5,ZNF79,SRRM5;浸潤(rùn)組3個(gè),為CPNE7,RBMXL3,ACSM2A;兩組共有3個(gè),為HECW1,ZNF273,TCHH。
　　第二部分:99例膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)6例HECW1基因突變,比例為6.06％,均為點(diǎn)突變,位于第11號(hào)外顯子,且與深度測(cè)序突變位點(diǎn)相同或在附近區(qū)域。其中,38例非浸潤(rùn)性膀胱癌組織DNA中,1例同義突變,比例為2.63％;61例浸潤(rùn)性膀胱癌組織DNA中,4例錯(cuò)義突變和1例無義

5、突變(即突變?yōu)榻K止密碼子),比例為8.20％,兩者突變比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),對(duì)照組10例未發(fā)現(xiàn)突變。免疫組化中,15例腫瘤組織9例陽性,陽性率60.0％,10例對(duì)照組1例陽性,陽性率10％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:(1)深度測(cè)序技術(shù),特別是全外顯子組測(cè)序,可以作為泌尿系腫瘤病因?qū)W研究中行之有效的實(shí)驗(yàn)手段。(2)Sanger測(cè)序是檢驗(yàn)深度測(cè)序結(jié)果的金標(biāo)準(zhǔn)。(3)HECW1可能是與膀胱癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的