鱉甲煎丸和羅格列酮藥物血清對(duì)TGFβ1刺激大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響和預(yù)防作用.pdf

1、肝硬化(cirrhosis of liver)是一種慢性、進(jìn)行性、彌漫性肝病,由各種病因引起肝細(xì)胞彌漫性壞死、再生,誘發(fā)纖維結(jié)締組織增生,導(dǎo)致小葉結(jié)構(gòu)破壞和假小葉重建,造成肝硬化。引起肝硬化的原因很多,不同地區(qū)的主要病因也不盡相同,歐美以酒精性肝硬化為主,我國(guó)則以肝炎肝硬化最多見。在世界范圍內(nèi),肝硬化己成為僅次于心腦血管病和惡性腫瘤的重大疾病,對(duì)人類危害極大。
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是多種慢性肝

2、病發(fā)展中共同的病理基礎(chǔ),也是由慢性肝炎向肝硬化進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成多于分解并在肝組織內(nèi)過度沉積是肝纖維化形成的原因,一方面是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)的活化和向成纖維細(xì)胞與肌成纖維樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致大量ECM的合成,另外一方面因?yàn)镋CM的降解減少導(dǎo)致其降解與合成的失衡促進(jìn)加強(qiáng)了肝纖維化的形成。所以肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化

3、的必經(jīng)階段,若病因不被消除,肝纖維化將逐漸加重,逐漸使血管和肝小葉等被改建,使正常結(jié)構(gòu)的肝臟收到破壞,假小葉、纖維間隔在中心靜脈區(qū)和匯管區(qū)出現(xiàn)形成,發(fā)展成為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1),是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的致纖維化細(xì)胞因子,是架設(shè)HSC和肝纖維化之間的橋梁。當(dāng)各種致病因素持續(xù)作用于肝臟時(shí),通過激活HSC的一系列機(jī)制,從而造成肝纖維化并進(jìn)展為肝

4、硬化。HSC的激活可分為兩個(gè)階段:啟動(dòng)階段和激活階段。啟動(dòng)激活階段改變?cè)缙诒硇秃突?使HSC對(duì)細(xì)胞因子如TGF-β1以及ECM和脂質(zhì)過氧化物改變產(chǎn)生應(yīng)答等非細(xì)胞因子的刺激;激活階段主要是細(xì)胞因子激發(fā)產(chǎn)生局部損傷,維持纖維化的形成和表型的激活。TGF-β1可促進(jìn)HSC活化,同時(shí)增強(qiáng)分泌細(xì)胞黏合素、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和HSC表達(dá),并通過自分泌因素的作用加強(qiáng)TGF-β1的自身表達(dá),另外還可抑制纖溶酶原激活物和基質(zhì)分解

5、素和膠原酶等基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMPs)的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和HSC表達(dá)金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor ofmetallo proteinase,TIMPs)和纖溶酶原激活物抑制因子。因此,在肝纖維化的發(fā)展過程中TGF-β1起著重要的始動(dòng)作用和激活作用,為抗纖維化治療中抑制TGF-β1的表達(dá)奠定了理論指導(dǎo)基礎(chǔ)。
　　 參與TGF-β信號(hào)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相

6、關(guān)蛋白統(tǒng)稱為Smad信號(hào)蛋白家族,為TGF-β下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的統(tǒng)稱。其中Smad2、Smad3、Smad4、Smad7參與TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Smad7是TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要抑制性調(diào)控蛋白,對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的反饋和交叉調(diào)控起關(guān)鍵作用,因此調(diào)控Smad7抑制TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)為肝纖維化的防治提供了新的途徑。
　　 西藥羅格列酮為過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisomeproli

7、ferators-activated receptor gamma,PPARγ)的合成配體,為PPARγ激動(dòng)劑,研究證實(shí)PPARγ活化可以抑制ECM mRNA的表達(dá),使ECM合成減少,PPARγ還可以通過抑制TGF-β1活化HSC的通路,促進(jìn)HSC凋亡,從而延緩肝纖維化。在中藥方面治療肝纖維化亦取得一定效果,中藥具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)的綜合藥理學(xué)作用,且其具有對(duì)肝纖維化的良好預(yù)防及對(duì)人體的低毒性反應(yīng)等特點(diǎn)。鱉甲煎丸以往研究證實(shí)具有抑

8、制膠原合成及HSC活化增殖,并改善肝功能的作用。但中藥復(fù)方成分復(fù)雜,如直接加入體外反應(yīng)體系,其非特異性理化因素會(huì)嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)。所以本研究采用血清藥理學(xué)方法,對(duì)正常大鼠提取藥物血清進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探討鱉甲煎丸的抗肝纖維化的作用機(jī)制。
　　 目的:通過觀察不同濃度鱉甲煎丸藥物血清對(duì)TGF-β1刺激的大鼠HSC活化增殖、ECM合成及TGF-β1/smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,探討其抗纖維化作用及可能作用機(jī)制,并與西藥羅格列酮相比較。<

9、br>　　 方法:1采用血清藥理學(xué)方法制備大鼠藥物血清:先配置TGF-β1濃度為5ug/L的DMEM培養(yǎng)液。并分別制備含2.5％,7.5%,12.5%甲煎丸藥物血清,TGF-β1濃度為5ug/L的DMEM培養(yǎng)液分別作為中藥低、中、高預(yù)防組干預(yù)培養(yǎng)基;制備含7.5%羅格列酮藥物血清,TGF-β1濃度為5ug/L的DMEM培養(yǎng)液作為西藥預(yù)防組干預(yù)培養(yǎng)基;制備含7.5%正常大鼠血清的培養(yǎng)基作為對(duì)照組干預(yù)培養(yǎng)基礎(chǔ)制備含7.5%正常大鼠血清,T

10、GF-β1濃度為5ug/L的DMEM培養(yǎng)液作為為模型組干預(yù)培養(yǎng)基。
　　 2藥物血清體外培養(yǎng)HSC及指標(biāo)檢測(cè):應(yīng)用HSC細(xì)胞株體外培養(yǎng)技術(shù),在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中貼壁后,換用無血清DMEM同步化培養(yǎng)24h,再換用各組干預(yù)培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞24h,進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè):(1)吸光度(optical density,OD):MTT法(2)Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ),層粘連蛋白(laminin,LN):放射免疫法(3)TIMP

11、-1mRNA,MMP-9mRNA,Smad7mRNA:反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainreaction,RT-PCR)
　　 結(jié)果:1 MTT結(jié)果顯示:模型組與空白對(duì)照組比較,模型組TGF-β1能顯著促進(jìn)HSCs增殖(P＜0.05);各藥物干預(yù)組與模型組比較,不同劑量鱉甲煎丸和羅格列酮藥物組均可明顯下調(diào)TGF-β1刺激的HSCsOD值(P＜0.05):各鱉甲煎丸組均

12、使OD值下調(diào)并呈量效關(guān)系,劑量越大,OD值越低(P＜0.05);鱉甲煎丸高劑量組和空白對(duì)照組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。;與羅格列酮組相比,鱉甲煎丸高劑量組OD值明顯減低(P＜0.05),鱉甲煎丸中劑量組OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),鱉甲煎丸低劑量組OD值明顯增高(P＜0.05)。
　　 2.放免結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,模型組及各藥物干預(yù)組LN,Col-Ⅳ含量明顯增高(P＜0.05);與模型組相比,各藥物干

13、預(yù)組LN,Col-Ⅳ含量均明顯減低(P＜0.05);鱉甲煎丸低、中、高劑量組LN,Col-Ⅳ含量依次減低(P＜0.05);與羅格列酮組相比,鱉甲煎丸高劑量組LN,Col-Ⅳ含量明顯減低(P＜0.05),鱉甲煎丸中劑量組LN,Col-Ⅳ含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),鱉甲煎丸低劑量組LN,Col-Ⅳ含量明顯增高(P＜0.05)。
　　 3,RT-PCR結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,模型組及各藥物干預(yù)組TIMP-1mRNA表達(dá)明顯增

14、高(P＜0.05),MMP-9mRNA、Smad7mRNA表達(dá)明顯增降低(P＜0.05);與模型組相比,各藥物干預(yù)組TIMP-1mRNA表達(dá)均明顯減低(P＜0.05),MMP-9mRNA、Smad7mRNA表達(dá)明顯增增高(P＜0.05);鱉甲煎丸低、中、高劑量組TIMP-1mRNA表達(dá)依次降低(P＜0.05),MMP-9mRNA、Smad7mRNA表達(dá)明依次增高(P＜0.05);與羅格列酮組相比,鱉甲煎丸高劑量組TIMP-1mRNA表達(dá)

15、明顯減低(P＜0.05)MMP-9mRNA、Smad7mRNA表達(dá)明顯增增高(P＜0.05),鱉甲煎丸中劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),鱉甲煎丸低劑量組和TIMP-1mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.05),MMP-9mRNA、Smad7mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1 TGF-β1可顯著促進(jìn)HSCs增殖活化和ECM合成。其作用可能是影響MMPs和TMPs之間的平衡,并通過抑制Smad7蛋白表達(dá),激活TGF