顯微鏡下型多血管炎患者血漿抗MPO抗體、銅藍蛋白和MPO之間相互作用的研究.pdf

1、背景與目的： 抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相關小血管炎是一組自身免疫性疾病。ANCA是其血清學診斷工具，以酒精固定的中性粒細胞為底物，應用間接免疫熒光法可分為胞漿型(cytoplasmic，c-ANCA)和環(huán)核型(perinuclear,p-ANCA)，其主要靶抗原分別為蛋白酶3(proteinase 3，PR3)和髓過氧化物酶(myeloperox

2、idase，MPO)。其中c-ANCA/PR3-ANCA主要見于韋格納肉芽腫病(Wegener's granulomatosis，WG)患者，而p-ANCA/MPO-ANCA則主要見于顯微鏡下型多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)患者。 MPA是中國最常見的ANCA相關系統(tǒng)性血管炎(ANCA associated systemicvasculitis，AASV)?？筂PO抗體被認為是MPA診斷的重

3、要血清學標記物，但是其發(fā)病機制并未完全清楚。MPO是中性粒細胞胞漿中的主要氧化酶之一，血漿銅藍蛋白是MPO的生理抑制劑?？筂PO抗體、血漿銅藍蛋白和MPO之間的相互作用可能在MPA的發(fā)病機制中起到重要的作用，但國內尚未見相關報道。 本實驗旨在研究用親和層析提取的原發(fā)MPA患者抗MPO抗體對MPO氧化活性的抑制作用，并進一步研究MPO、銅藍蛋白和抗MPO抗體之間的關系，以期對MPA的發(fā)病機制提供理論基礎。 實驗方法：

4、 11 例患者血漿均來自北京大學第一醫(yī)院腎內科1998年10月-2006年4月收治的抗MPO抗體陽性的原發(fā)性MPA患者，12例健康獻血員的血清作為正常對照。應用蛋白G親合層析的方法純化血清中的免疫球蛋白G(IgG)，應用MPO親和層析柱純化IgG中的抗MPO抗體，應用高度純化的人中性粒細胞MPO在0．127mg/ml聯(lián)大茴香胺，0．001﹪過氧化氫條件下建立穩(wěn)定的酶反應體系。分別測定在不同濃度的患者抗MPO抗體、銅藍蛋白和正常人IgG

5、存在條件下MPO的酶氧化活性，并比較MPA患者的抗MPO抗體和銅藍蛋白抑制MPO的酶氧化活性的差異。應用競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進一步測定抗MPO抗體、銅藍蛋白和MPO之間的相互作用。在同等條件下，MPO的酶氧化活性的下降=30﹪視為有抑制作用。 實驗結果: 1．應用終濃度為40ng/ml的MPO建立穩(wěn)定的210μl容積的酶反應體系，米氏常數(Km)為0．705mM。 2．11名MPA患者中有7名患

6、者的抗MPO抗體能夠以非競爭性抑制的方式劑量依賴性的抑制MPO的活性。平均抑制率為32﹪，平均抑制常數(Ki)為0．124mg/ml(Dixon plot作圖法)。 3．銅藍蛋白能夠以競爭性抑制的方式劑量依賴和時間依賴性的抑制MPO的活性。平均抑制率為75﹪，平均抑制常數(Ki)為0．547 mg/ml(Dixon plot作圖法)。 4．抗MPO抗體能夠抑制MPO和銅藍蛋白之間的結合，最大抑制率可達到75．4±11．6