乙型肝炎病毒HBx蛋白與血漿銅藍(lán)蛋白的相互作用及對其功能影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一種呈世界性分布的,危害嚴(yán)重的傳染病,是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要原因。但其具體致病的機(jī)制尚未完全明確。
　　HBV基因組為全長僅為3.2kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA,含四個(gè)部分重疊的開放讀碼框(Open reading frame,ORF):P,S,C,X;其中HBx蛋白是由X讀碼框編碼的,含有154個(gè)氨

2、基酸,分子量為16.5kD,是一個(gè)多功能蛋白,在HBV感染過程中發(fā)揮著重要的作用,是HBV重要的致病因子之一。本研究在先前CytoTrap酵母雙雜交初步篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,驗(yàn)證了HBx蛋白可與血漿銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin,Cp)在酵母中發(fā)生相互作用,并進(jìn)一步確定了二者在體內(nèi)和體外均可發(fā)生相互作用,最后探討二者相互作用后HBx對Cp的功能影響,更有助于深入了解HBV的致病機(jī)制。
　　本研究第一部分在CytoTrap酵母雙雜

3、交初步篩選的基礎(chǔ)上,抽提出一個(gè)推定陽性克隆的獵物文庫質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后送測序分析,鑒定為血漿銅藍(lán)蛋白(serum ceruloplasmin),并將誘餌質(zhì)粒和抽提出的獵物文庫質(zhì)粒重新共轉(zhuǎn)化到酵母中,利用CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)初步驗(yàn)證了HBx與Cp可在酵母中發(fā)生相互作用。
　　本研究第二部分通過GSTpull-down和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)一步證實(shí)了HBx蛋白與

4、Cp可以在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)存在相互作用,并且利用CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)確定了與Cp的發(fā)生相互作用是HBx蛋白的第51-80氨基酸區(qū)段。
　　本研究的第三部分旨在探討二者相互作用后,HBx對Cp及其相關(guān)功能的影響。利用Cp和HBx共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2,通過檢測細(xì)胞內(nèi)源性活性氧(ROS),氧自由基等氧化應(yīng)激指標(biāo),發(fā)現(xiàn)HBx可通過與Cp的相互作用抑制其抗氧化功能,間接參與了HBV的致病過程,提示Cp可能可作為抗HBV治療的一個(gè)