炭疽抗原的免疫機(jī)制及其蛋白質(zhì)組分的二維電泳分析.pdf

1、炭疽芽孢桿菌芽孢是重要生物恐怖戰(zhàn)劑之一，現(xiàn)人用炭疽疫苗有兩種，即炭疽減毒活芽孢苗和炭疽弱毒株無菌培養(yǎng)濾液佐劑吸附苗(AVA)?？紤]到毒力恢復(fù)的潛在危險(xiǎn)減毒活芽孢苗僅俄羅斯(前蘇聯(lián))和我國(guó)使用；AVA苗存存疫苗組分不清、對(duì)吸入性炭疽保護(hù)率較低，接種次數(shù)多，成分復(fù)雜，副反應(yīng)較人，美軍中使用出現(xiàn)拒絕接種事件等問題，AVA面臨急待改進(jìn)的迫切局面。莊漢瀾小組在上世紀(jì)70年代也研制出保護(hù)效果良好的無菌培養(yǎng)濾液鋁膠吸附苗(AVA)，人體接種安全、反應(yīng)

2、輕微，由于條件所限，未能作組分鑒定。為分析炭疽抗原的蛋白構(gòu)成，探討炭疽抗原的免疫機(jī)制，為疫苗改進(jìn)和開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)進(jìn)行了如下工作，獲得初步結(jié)果。 首先建立了制備炭疽桿菌A16R株炭疽保護(hù)性抗原的適用的實(shí)驗(yàn)條件：培養(yǎng)基處方為：酸水解酪蛋白4g/L，酵母粉1g/L0．06MCael22．5ml，0．02MMgS042．5ml，0．03M磷酸鉀緩沖液40ml，蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，分裝5瓶(200ml／瓶)。115℃20分鐘

3、高壓滅菌，臨種菌前分別無菌加入0．05MFeS04、0．0006MMnS04各2ml，20％葡萄糖lml，混勻后，加入5ml15％NaHC03／瓶，用1NHCl調(diào)PH至7．8-8．0，接種活化2代種子液，菌量3×107／瓶；37~C200rpm振搖培養(yǎng)。觀察了培養(yǎng)液的PH值、殘?zhí)橇颗c炭疽抗原含量間的變化規(guī)律，找到了以培養(yǎng)液PH值改變曲線作為檢測(cè)培養(yǎng)液中炭疽抗原消長(zhǎng)的指標(biāo)，于培育后9小時(shí)和16小時(shí)中止培養(yǎng)，0．2μm過濾除菌，收集濾液、濃

4、縮即為炭疽抗原。共制備4批炭疽抗原，供后續(xù)免疫機(jī)制和蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究。炭疽抗原經(jīng)A1(OH)3吸附即為AVA。用培育9小時(shí)的炭疽抗原制成的AVA免疫小鼠，對(duì)炭疽桿菌Vollum株10LD50攻擊的保護(hù)率為80％-100％。 用ELISA方法比較了三種炭疽抗原免疫小鼠特異性抗體形成的規(guī)律。對(duì)本身抗原的抗體形成規(guī)律與一般抗體形成的規(guī)律相一致，但不同免疫組小鼠對(duì)非本身抗原的抗體形成則有所不同。在芽孢苗和AVA免疫組小鼠血清中檢測(cè)到抗

5、三種抗原(滅活芽孢、9小時(shí)炭疽抗原、rPA)的IgG抗體，rPA免疫組血清中僅檢測(cè)到抗rPA抗體；抗體亞型以IgGl最高，IgG2b居中，IgG2a最低；抗rPA抗體未檢測(cè)到IgG2a；三組IgG抗體中皆未檢測(cè)到IgG2c和IgG3。提示，制備的炭疽抗原中含少量PA，芽孢和AVA免疫不僅產(chǎn)生特異性體液免疫，也刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫。 用ELISPOT方法檢測(cè)的AVA免疫小鼠脾細(xì)胞中對(duì)炭疽抗原的IL-4和IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)高達(dá)300／

6、2×lO5和226／2×105，明顯高于Al(0H)3對(duì)照組。提示AVA可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，這與ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果相符。支持除PA外有其它成分參與抗炭疽免疫的論點(diǎn)。 為了解炭疽抗原的蛋白組成，通過二維電泳比較了9小時(shí)、16小時(shí)培育炭疽抗原的蛋白分布，9小時(shí)炭疽抗原蛋白點(diǎn)清晰、分布均勻，分子量介于14～90KD之間；16小時(shí)蛋白點(diǎn)主要集中于40KD以下。運(yùn)用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)手段，從9小時(shí)炭疽抗原的二維電泳凝膠中