半枝蓮指紋圖譜分析及其提取物抗腫瘤活性研究.pdf

1、背景 中藥現(xiàn)代化是傳統(tǒng)藥物發(fā)展的必然趨勢。我國中藥資源豐富，理論基礎雄厚，中藥產(chǎn)業(yè)有著極大的發(fā)展?jié)摿ΑＴ谥兴幀F(xiàn)代化的前提下，藥物的研究既應符合中醫(yī)臨床用藥的習慣，又應與藥品質(zhì)量可控的國際要求接軌。這對中藥研究提出了挑戰(zhàn)。 在藥品質(zhì)量的控制問題上，中藥的難度要比西藥大得多，因為西藥無論是單方還是復方制劑，都是由明確的化合物組成的，可以對其進行定量定性分析。而中藥則不同，許多中藥及其制劑的有效成分尚未確定，也缺乏相應的對照品

2、。在傳統(tǒng)中藥學中，有道地藥材的說法，說明古人已認識到藥材的來源、產(chǎn)地等客觀因素對中藥材質(zhì)量的影響。藥材采集的背景不同，極有可能產(chǎn)生有效成分的含量甚至是藥效的極大差別。目前我國藥材的種植、采收及制作較為混亂，沒有統(tǒng)一標準。且我國中藥農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代化才剛剛開始。中藥走向世界的一個“瓶頸”問題是中藥內(nèi)在質(zhì)量的保證問題，評價中藥及其制劑質(zhì)量的標準要得到國際認可和接收，因此，需要有一個既符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，又符合現(xiàn)代化藥品質(zhì)控的技術(shù)手段支持。

3、 隨著現(xiàn)代分析儀器的不斷出現(xiàn)以及分析技術(shù)的不斷深入和完善，產(chǎn)生了中藥指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)。中藥指紋圖譜是指某種(或某種產(chǎn)地)中藥材或中藥經(jīng)過適當處理后，運用現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥化學信息以圖形(圖像)的方式進行表征并加以描述，得到能標志該種中藥材或中成藥特征的色譜圖譜。它能確保中藥、中成藥成分的一致性、療效的安全性及可靠性，能全面反映中藥材所含化學成分的種類與數(shù)量，從整體上控制藥材質(zhì)量，進而提高中藥的質(zhì)量標準水平，逐步實現(xiàn)中藥材、中成藥、中

4、草藥(天然藥物)等的質(zhì)量標準化，是目前國際上公認的、較好的反映了中藥材及中藥制劑質(zhì)量標準的質(zhì)量控制方法。 半枝蓮(ScutellariaeBarbataeD.Don)又名狹葉韓信草、紫蓮草、并頭草、牙刷草、半向花等等。臨床應用廣泛，是一味具有研究價值的藥材，遍布于華中、華南、華東、華北和西南等地。由文獻可知半枝蓮具有一種多名性，易混用；半枝蓮主要含有的化學成分有黃酮類、萜類、多糖、生物堿、甾體等等?，F(xiàn)行藥典(2005版一部)中以

5、野黃芩苷和總黃酮的含量來控制半枝蓮的質(zhì)量，既不能全面體現(xiàn)半枝蓮的藥效，也不能從整體上評價半枝蓮的質(zhì)量，不利于半枝蓮的臨床應用和國際化。而半枝蓮指紋圖譜的研究目前未見報道。因此，研究半枝蓮的指紋圖譜，為該藥的質(zhì)量控制提供一個可行的依據(jù)，具有非常重要和緊迫的現(xiàn)實意義。 半枝蓮的臨床抗腫瘤研究證實，半枝蓮既能夠活血化瘀，又能涼血止血，止血而不留瘀，化瘀而不傷正，有效抗腫瘤而對機體副作用小，是半枝蓮治療腫瘤的一大優(yōu)勢。所以，半枝蓮散瘀止

6、血、活血化瘀、清熱解毒、抗腫瘤的有效部位和有效成分值得研究。結(jié)合半枝蓮指紋圖譜，進行半枝蓮體外抗腫瘤活性研究，實現(xiàn)譜效結(jié)合，有望在抗腫瘤新藥研究中開發(fā)一種行之有效的新途徑。 目的 1.建立半枝蓮HPLC指紋圖譜，獲得半枝蓮指紋圖譜的量化特征，為半枝蓮及其產(chǎn)品進入國際市場與國際接軌提供實驗依據(jù)； 2.采用人肝癌細胞株Hep-G2、QGY作為研究對象，觀察半枝蓮提取物(ExtractofScutellariaeBar

7、batae，ESB)對Hep-G2、QGY細胞體外增殖的影響并初步探討其機制，為其能否應用于肝細胞癌的臨床治療提供理論依據(jù)。 方法 1.半枝蓮指紋圖譜的建立：采用HPLC法對不同來源(產(chǎn)地)的半枝蓮樣品進行分析。對色譜條件(包括流動相、洗脫梯度、色譜柱檢測波長等)進行優(yōu)化，最終應用Agilent高效液相色譜儀、四元泵、在線脫氣、色譜柱MerkLichrospherRp-18e、梯度線性洗脫(甲醇和乙醇酸水溶液，流速1.0

8、ml/min-1)、檢測波長270nm，對不同產(chǎn)地、批次的半枝蓮及其混淆物半邊蓮進行指紋圖譜比較，建立半枝蓮HPLC指紋圖譜，應用中藥色譜指紋圖譜計算機輔助相似性評價系統(tǒng)軟件對半枝蓮HPLC指紋圖譜進行分析評價； 2.ESB的制備：10倍量石油醚回流提取兩次后，再用80％乙醇回流提取三次，每次1.5h，用量分別為10倍量、8倍量、8倍量。乙醇提取液減壓回收溶劑至成濃縮提取液。25g提取物，通過萃取分離、過濾，濾渣為A，濾液用乙醚

9、萃取，再用乙酸乙酯萃取，得萃取液分別回收溶劑，所得固形物分別為B、C。剩下的液體回收溶劑，得固形物D。A、B、C、D分別用蒸餾水定容。使用時用1×PBS稀釋至所需的藥物濃度，并用氯化鈉、尿素等調(diào)節(jié)滲透壓至等滲； 3.ESB抗人肝癌細胞株增殖及其機制的研究：采用人肝癌細胞株Hep-G2、QGY作為研究對象，MTT法檢測不同濃度和作用時間的ESB對細胞增殖的抑制效應；光鏡及透射電鏡觀察細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變；流式細胞儀分析4種ES

10、B對Hep-G2、QGY細胞周期的分布及凋亡相關蛋白表達的影響。 結(jié)果 1.半枝蓮指紋圖譜的建立： 采用高效液相色譜儀分析半枝蓮，得到半枝蓮藥材有許多峰，但共有指紋峰只有13個；確認2個峰的歸屬為野黃芩苷和木犀草素。能辨別出混淆品半邊蓮； 2.4種ESB對Hep-G2、QGY細胞增殖的抑制作用： ESB對兩株肝癌細胞的增殖均有明顯的抑制作用。抑制率隨著藥物濃度的增加而增加，有劑量依賴關系；隨著作用

11、時間的延長而增加，有時間依賴關系。到一定的時間和濃度，隨著ESB濃度的增加，抑制率增加不再明顯，呈現(xiàn)平臺效應。ESB對不同的人肝癌細胞株的抑制率不同。A提取物對Hep-G2細胞和QGY細胞的抑制作用大于B、C、D3種提取物。A、B、C、D4種ESB作用Hep-G2細胞72h的中效濃度分別為0.0143g/mL、0.0610g/mL、0.0676g/mL、0.0673g/mL，A、B、C、D4種ESB作用QGY細胞72h的中效濃度為分別為

12、0.0368g/mL、0.08873g/mL、0.0975g/mL、0.0904g/mL。A、B、C、D對Hep-G2、QGY細胞增殖的抑制作用在時間及濃度方面均有顯著性差異； 3.A、B、C、D4種ESB作用后Hep-G2、QGY形態(tài)的改變： Hep-G2、QGY細胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯的改變。對照組細胞呈梭形或星形，形態(tài)飽滿，胞漿較豐富，嗜伊紅，細胞核大，異型性明顯。細胞經(jīng)1/2中效濃度的ESB處理后，出現(xiàn)細胞體積縮小，細

13、胞間連接減少，胞漿濃縮，核固縮深染，呈現(xiàn)凋亡早期的形態(tài)學改變。4種ESB對細胞的形態(tài)學影響基本類似； 4.A、B、C、D4種ESB作用后Hep-G2、QGY細胞超微結(jié)構(gòu)的改變： 電鏡觀察未處理組Hep-G2細胞體積較大，核漿比例亦大；核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，核仁明顯，可見多個核仁；胞漿內(nèi)可見核糖體及線粒體。藥物處理后，Hep-G2細胞皺縮，胞染色質(zhì)邊集，部分胞質(zhì)脫落形成出芽，形成凋亡小體。4種ESB對Hep-G2細

14、胞的超微結(jié)構(gòu)的影響基本類似。 對照組QGY細胞電鏡觀察細胞膜完整，表面可見微絨毛；細胞核大，表面畸形，核仁明顯，可見有多個核仁，常染色質(zhì)均勻；胞漿內(nèi)可見核糖體及線粒體。藥物處理后，QGY細胞皺縮，胞漿濃縮、碎裂，形成含有胞質(zhì)的凋亡小體，此特征符合細胞凋亡形態(tài)學變化。4種ESB對QGY細胞的超微結(jié)構(gòu)的影響基本類似。 5.ESB作用72h后對Hep-G2、QGY細胞周期分布及凋亡的影響: 作用72h時A-ESB、B-

15、ESB、D-ESB作用可使Hep-G2細胞G2/M期細胞增多，S期細胞減少。4種ESB處理Hep-G2細胞72h與對照組Hep-G2凋亡細胞比例接近。作用72h時，A-ESB、B-ESB、C-ESB作用可使QGY細胞G2/M期細胞減少，S期細胞增多。4種ESB處理QGY細胞72h與對照組QGY凋亡細胞比例接近； 6.ESB作用后Hep-G2、QGY凋亡相關基因蛋白表達的改變： 4種ESB作用于Hep-G2細胞72h后，B

16、cl-2、Bax、Fas蛋白表達率有升有降；4種ESB作用于QGY細胞72h后，可見Bcl-2、Fas蛋白表達率升高，Bax蛋白表達率有升有降。 結(jié)論 1.本課題所建立的半枝蓮指紋圖譜可用于半枝蓮的鑒定，共有指紋峰有13個，其中有2個峰歸屬為野黃芩苷和木犀草素； 2.ESB在體外具有抑制人肝癌細胞株Hep-G2、QGY增殖的作用，同時這種作用具有劑量和時間依賴性； 3.ESB可將人肝癌細胞Hep-G2的細